本發(fā)明屬于基因工程，具體涉及一種具有細(xì)胞粘附性的重組羥基化人iii型膠原蛋白及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、膠原蛋白是哺乳動(dòng)物中最重要和最豐富的蛋白質(zhì)之一，是在人體的皮膚、結(jié)締組織和骨骼以及其它組織中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)蛋白。在人體內(nèi)膠原蛋白的含量約為總蛋白質(zhì)的30％。膠原蛋白是一種結(jié)構(gòu)蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。ⅲ型膠原蛋白由三條肽鏈向右卷曲扭成三股螺旋狀。一級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，其多肽鏈很長(zhǎng)的區(qū)段序列是由gly-x-y氨基酸序列重復(fù)而成。其中，x通常為脯氨酸，y通常為羥脯氨酸和羥賴氨酸，后兩種氨基酸在其他蛋白質(zhì)中很少見。

2、因天然膠原蛋白序列上存在4個(gè)粘附性較低的天然整合素位點(diǎn)，致使其粘附性較差。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種具有細(xì)胞粘附性的重組羥基化人iii型膠原蛋白及其制備方法和應(yīng)用，提高膠原蛋白的粘附性。

2、本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種具有細(xì)胞粘附性的重組人ⅲ型膠原蛋白，氨基酸序列如seq?id?no.1所示，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3、一種具有羥基化功能且增強(qiáng)如seq?id?no.1編碼蛋白粘附性的序列，其氨基酸序列如seq?id?no.4所示，核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

4、所述重組人ⅲ型膠原蛋白用于制備細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。

5、一種表達(dá)載體，包含如seq?id?no.2所示的核苷酸序列。

6、一種表達(dá)載體，包含如seq?id?no.5所示的核苷酸序列。

7、一種宿主細(xì)胞，包含上述任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。

8、所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的任意一種。

9、一種所述宿主細(xì)胞制備重組人ⅲ型膠原蛋白的方法，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)重組人ⅲ型膠原蛋白表達(dá)后進(jìn)行純化，獲得重組人ⅲ型膠原蛋白。

10、所述純化的方法選自鹽析法、超濾法、親和層析法和凝膠過(guò)濾層析法中的任意一種。

11、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過(guò)對(duì)全長(zhǎng)天然iii型膠原蛋白的9個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行替換，在不改變天然全長(zhǎng)氨基酸總長(zhǎng)度的情況下替換了4個(gè)粘附性較低的天然整合素位點(diǎn)，同時(shí)保留端肽使其具有形成三螺旋結(jié)構(gòu)的潛力。通過(guò)這種改造方式將膠原蛋白的粘附性提高27％以上，且其分子量適中，容易制備，同時(shí)羥基化使其表達(dá)更穩(wěn)定

12、本發(fā)明的重組膠原蛋白未去除膠原編碼區(qū)c-端、n-端的全長(zhǎng)鏈序列，結(jié)合羥基化具有形成三螺旋結(jié)構(gòu)的能力。

13、本發(fā)明制備的重組膠原蛋白由畢赤酵母工程菌表達(dá)而得，該蛋白無(wú)內(nèi)毒素隱患，且該蛋白不攜帶組氨酸標(biāo)記，可通過(guò)分子篩進(jìn)行純化，最終直接可得目的蛋白，不需要額外切除組氨酸標(biāo)記序列。

14、本發(fā)明所述的方法所制備的重組膠原蛋白，可以有效地進(jìn)行免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、凝血、腫瘤轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)傷愈合。

15、本發(fā)明所述的重組人羥基化iii型膠原蛋白制備方法適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，并且制備出的產(chǎn)品沒(méi)有動(dòng)物來(lái)源的感染源，因此生物安全性更高。

技術(shù)特征：

1.一種具有細(xì)胞粘附性的重組人ⅲ型膠原蛋白，其特征在于，氨基酸序列如seq?idno.1所示。

2.一種編碼如權(quán)利要求1所述重組人ⅲ型膠原蛋白的基因，其特征在于，核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

3.一種具有羥基化功能且增強(qiáng)如權(quán)利要求1所述重組人ⅲ型膠原蛋白粘附性的序列，其特征在于，氨基酸序列如seq?id?no.4所示，核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組人ⅲ型膠原蛋白的應(yīng)用，其特征在于，所述重組人ⅲ型膠原蛋白用于制備細(xì)胞粘附促進(jìn)劑。

5.一種表達(dá)載體，其特征在于，包含如權(quán)利要求2所述的核苷酸序列。

6.一種表達(dá)載體，其特征在于，包含如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列。

7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含如權(quán)利要求5或權(quán)利要求6任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母、釀酒酵母、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的任意一種。

9.利用權(quán)利要求7所述宿主細(xì)胞制備重組人ⅲ型膠原蛋白的方法，其特征在于，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)重組人ⅲ型膠原蛋白表達(dá)后進(jìn)行純化，獲得重組人ⅲ型膠原蛋白。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述純化的方法選自鹽析法、超濾法、親和層析法和凝膠過(guò)濾層析法中的任意一種。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組羥基化人III型膠原蛋白及其制備方法和應(yīng)用。一種具有細(xì)胞粘附性的重組羥基化人III型膠原蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明通過(guò)對(duì)全長(zhǎng)天然III型膠原蛋白的9個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行替換，在不改變天然全長(zhǎng)氨基酸總長(zhǎng)度的情況下替換了4個(gè)粘附性較低的天然整合素位點(diǎn)，同時(shí)保留端肽使其具有形成三螺旋結(jié)構(gòu)的潛力。通過(guò)這種改造方式將膠原蛋白的粘附性提高27％以上，且其分子量適中，容易制備，同時(shí)羥基化使其表達(dá)更穩(wěn)定。

技術(shù)研發(fā)人員：李偉娜,張雅倩,范代娣,袁艷婷,鄧鑫月,江奇逸
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西北大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6