本發(fā)明屬于分子生物學，具體涉及一種dsrna標準品濃度檢測方法及其應用。

背景技術：

1、dsrna，全稱為double-stranded?rna，譯為雙鏈核糖核酸。在ivt(mrna體外合成)的過程中，t7?rna聚合酶可能以rna或dna(模板鏈與非模板鏈)為模板進行轉錄，形成不同類型的dsrna副產(chǎn)物。dsrna所表現(xiàn)出的免疫原性，一方面會因為自身免疫系統(tǒng)與翻譯系統(tǒng)間的反饋調(diào)節(jié)而降低mrna的翻譯效率；另一方面，dsrna使機體形成記憶免疫，當mrna藥物需要重復給藥時，會造成藥物效力降低。因此，需要在mrna疫苗藥物的生產(chǎn)過程中嚴格控制dsrna的含量，這就要求生產(chǎn)廠商能對dsrna進行精確定量檢測。目前生產(chǎn)廠商使用的商品化試劑盒主要基于elisa法，elisa是以體外抗原抗體反應為基礎，將抗原抗體特異性反應與酶的高效催化作用相結合的一種檢測方法，靈敏度可達(pg/ml)水平。它是目前商業(yè)應用最為成熟的免疫分析方法之一，在醫(yī)學實驗、臨床診斷、生物制藥方面的運用也極為廣泛。這種試劑盒需要通過dsrna標準品建立標準曲線來定量，dsrna標準品的賦值定量成為試劑盒準確性的關鍵。目前針對dsrna標準品主要的定量方法是紫外分光光度法、熒光染料法、毛細管電泳法。

2、紫外分光光度法的原理是利用組成核酸分子的堿基，由于含有芳香環(huán)結構，具有紫外吸收的特性。吸收值在波長250-270nm之間，最大吸收波長是260nm。通過測量260nm波長條件下，核酸的吸光度值，從而實現(xiàn)對核酸的定量檢測。由于游離核苷酸、鹽類及有機化合物也有一定的紫外吸收，因此，當樣本純度不佳，或者摻有其他類型的樣本時，分光光度法不一定能準確反映核酸的總量。

3、熒光染料法是利用與rna特異性結合的染料，這些熒光染料與rna結合時才能發(fā)出熒光信號，熒光信號與rna濃度成正比，根據(jù)rna標準品建立的標準曲線，可以對rna進行精準定量，其檢測過程需使用酶標儀或熒光計。但由于暫無能特異性結合雙鏈rna的染料，如果直接采用rna定量試劑對dsrna進行定量存在定量不準的情況，雙鏈rna的特殊結構也會影響染料的特異性結合。

4、毛細管電泳對核酸進行定量是基于熒光染料法，它能夠同時給出條帶和濃度信息。利用已知片段大小的ladder，生成遷移時間與片段大小的標準曲線，即可通過不同遷移時間來確定樣品的片段大小。通過樣品峰面積對已知濃度的marker或ladder面積的比值來對樣品進行定量。同樣的由于dsrna結構的特殊性，染料特異性結合單鏈rna，雙鏈rna同樣會影響染料的特異性結合。

5、由于mrna藥物廠家會采用不同修飾的utp進行合成mrna，采用不同化學修飾核苷酸的進行合成mrna可有效降低mrna的自免疫原性。因為tlr7和tlr8結合在mrna的gu-rich區(qū)域，所以修飾的尿嘧啶如putp(ψ)(假尿苷)、n1-me-putp(n1-甲基假尿苷)和5-ome-utp(5-甲基尿苷)可以抑制prrs(pattern?recognition?receptors)對mrna的識別。因此dsrna檢測試劑盒(elisa法)中一般也會采用不同修飾的dsrna標準品。這些不同修飾的dsrna標準品在紫外分光光度法中也存在不同的吸光度，在熒光染料法中可能也會影響染料的特異性結合，在毛細管電泳法中也會因為分子量差異影響遷移時間。因此需要一種不受修飾類型影響的定量方法。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中檢測準確度不佳，無法避免不同修飾類型的影響的問題。

2、為此，本發(fā)明提供了一種dsrna標準品濃度檢測方法，包括以下步驟：

3、s1、根據(jù)待測dsrna序列設計特異性逆轉錄引物；

4、s2、將待測dsrna標準品與特異性逆轉錄引物混合，得到混合物；

5、s3、向混合物中加入逆轉錄體系進行逆轉錄；

6、s4、對逆轉錄產(chǎn)物進行梯度稀釋，采用qpcr對不同梯度逆轉錄產(chǎn)物進行檢測；

7、s5、根據(jù)qpcr結果，選擇合適濃度梯度的逆轉錄產(chǎn)物進行ddpcr；

8、s6、通過qpcr檢測得到的ct值和ddpcr得到的拷貝數(shù)計算dsrna標準品的濃度。

9、具體的，上述步驟s2具體為：對待測dsrna標準品進行定量檢測，根據(jù)定量結果稀釋到一定濃度后與特異性逆轉錄引物混合，得到混合物。

10、具體的，上述步驟s2中采用紫外分光光度法、熒光染料法或毛細管電泳對待測dsrna標準品進行定量檢測。

11、具體的，上述步驟s2中dsrna標準品稀釋濃度在0.02-2ng/μl。

12、具體的，上述步驟s3中加入逆轉錄體系之前，還包括對混合物進行熱處理。

13、具體的，上述步驟s3中熱處理溫度為65-95℃，熱處理時間為5min。

14、具體的，上述步驟s5中合適濃度梯度為qpcr檢測ct值在23-28范圍內(nèi)的梯度。

15、具體的，上述步驟s6具體為：計算qpcr檢測結果中稀釋100倍后逆轉錄產(chǎn)物的ct值與進行ddpcr檢測的稀釋物對應的ct值之間的差值，根據(jù)ct差值計算梯度間的換算倍數(shù)，通過換算倍數(shù)和ddpcr得到的拷貝數(shù)計算dsrna標準品的濃度。

16、具體的，上述dsrna標準品的質量濃度＝dsrna分子量*拷貝數(shù)*換算倍數(shù)。

17、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：

18、本發(fā)明提供的這種dsrna標準品濃度檢測方法利用dsrna在高溫的情況下可變性成單鏈的特性，將dsrna和特異性引物混合加熱后迅速冷卻讓rna與引物結合，再使用高效率的逆轉錄酶進行逆轉錄，得到的逆轉錄產(chǎn)物進行梯度稀釋并進行qpcr和ddpcr檢測，通過ct差值和ddpcr絕對定量的拷貝數(shù)濃度推算原樣品濃度，實現(xiàn)對dsrna標準品的絕對定量。該方法不受修飾類型的影響，只與dsrna序列有關，從原理上避免了不同修飾的差異影響，可在mrna疫苗藥物的生產(chǎn)過程中用于嚴格控制dsrna的含量。

19、以下將結合附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明。

技術特征：

1.一種dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權利要求1所述dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于，所述步驟s2具體為：對待測dsrna標準品進行定量檢測，根據(jù)定量結果稀釋到一定濃度后與特異性逆轉錄引物混合，得到混合物。

3.如權利要求2所述dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟s2中采用紫外分光光度法、熒光染料法或毛細管電泳對待測dsrna標準品進行定量檢測。

4.如權利要求2所述dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟s2中dsrna標準品稀釋濃度在0.02-2ng/μl。

5.如權利要求1所述dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟s3中加入逆轉錄體系之前，還包括對混合物進行熱處理。

6.如權利要求1所述dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟s3中熱處理溫度為65-95℃，熱處理時間為5min。

7.如權利要求1所述dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于：所述步驟s5中合適濃度梯度為qpcr檢測ct值在23-28范圍內(nèi)的梯度。

8.如權利要求1所述dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于，所述步驟s6具體為：計算qpcr檢測結果中稀釋100倍后逆轉錄產(chǎn)物的ct值與進行ddpcr檢測的稀釋物對應的ct值之間的差值，根據(jù)ct差值計算梯度間的換算倍數(shù)，通過換算倍數(shù)和ddpcr得到的拷貝數(shù)計算dsrna標準品的濃度。

9.如權利要求8所述dsrna標準品濃度檢測方法，其特征在于：所述dsrna標準品的質量濃度＝dsrna分子量*拷貝數(shù)*換算倍數(shù)。

10.如權利要求1-9任意一項所述dsrna標準品濃度檢測方法在mrna疫苗藥物生產(chǎn)中的應用。

技術總結
本發(fā)明屬于分子生物學技術領域，具體提供了一種dsRNA標準品濃度檢測方法，包括以下步驟：S1、根據(jù)待測dsRNA序列設計特異性逆轉錄引物；S2、將待測dsRNA標準品與特異性逆轉錄引物混合，得到混合物；S3、向混合物中加入逆轉錄體系進行逆轉錄；S4、對逆轉錄產(chǎn)物進行梯度稀釋，采用qPCR對不同梯度逆轉錄產(chǎn)物進行檢測；S5、根據(jù)qPCR結果，選擇合適濃度梯度的逆轉錄產(chǎn)物進行ddPCR；S6、通過qPCR檢測得到的CT值和ddPCR得到的拷貝數(shù)計算dsRNA標準品的濃度。本發(fā)明提供的這種方法不受修飾類型的影響，只與dsRNA序列有關，從原理上避免了不同修飾的差異影響，可在mRNA疫苗藥物的生產(chǎn)過程中用于嚴格控制dsRNA的含量。

技術研發(fā)人員：耿玉杰,李健,楊諾
受保護的技術使用者：深圳瀚智生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2