本發(fā)明涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具體涉及一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在再生醫(yī)學(xué)和臨床治療中，由于間充質(zhì)干細(xì)胞(mscs)具有自我更新和多系分化的能力，已成為胚胎干細(xì)胞富有前景的替代物近年來，陸續(xù)有臨床研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)免疫性疾病、心肌損傷、肝臟疾病、肺疾病、腎臟疾病和糖尿病均有明顯的治療作用。mscs是一種重要的參與組織再生的細(xì)胞庫(kù)。在組織損傷引起的特殊信號(hào)作用下，mscs遷移到受損部位，在局部聚集增殖，依據(jù)不同的損傷信號(hào)沿著不同的途徑分化。

2、mscs易于分離擴(kuò)增，然而其增殖能力受到許多因素影響，包括來源于個(gè)體組織、培養(yǎng)條件和持續(xù)的傳代的影響。在不加基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞在體外增殖的速率較慢，擴(kuò)增到臨床應(yīng)用數(shù)量級(jí)所需的時(shí)間較長(zhǎng)。因此，尋找和克隆表達(dá)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力相關(guān)的基因，不僅有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，也有利于臨床治療的廣泛應(yīng)用。

3、生長(zhǎng)分化因子5(growth/differentiationfactor5,gdf5)是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員之一，也稱作軟骨形成發(fā)生蛋白(cdmp-1)或骨形態(tài)發(fā)生蛋白14(bmp-14)，作為組織工程的細(xì)胞因子之一，不僅可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，還能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化，對(duì)軟骨和骨損傷具有較好的修復(fù)作用。

4、關(guān)節(jié)炎是一種關(guān)節(jié)軟骨的退行病變，同時(shí)還伴有軟骨下骨硬化、骨囊性變和滑膜炎等，這些共同促進(jìn)了關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。有研究表明，gdf5是關(guān)節(jié)炎發(fā)展的保護(hù)因素，外源性添加gdf5可以減輕關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。另外，也有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶9(mmp9)與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

5、目前，還沒有任何關(guān)于聯(lián)合gdf5和mmp9治療關(guān)節(jié)炎的研究報(bào)道。因此，需要對(duì)此展開研究有效治療關(guān)節(jié)炎。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是聯(lián)合gdf5和mmp9兩個(gè)靶點(diǎn)，將gdf5基因和抗mmp9納米抗體修飾到間充質(zhì)干細(xì)胞上，治療關(guān)節(jié)炎。

2、本發(fā)明的一個(gè)方面是提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞，具體的是將gdf5基因和抗mmp9納米抗體修飾在間充質(zhì)干細(xì)胞上。

3、優(yōu)選地，gdf5基因的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，其核苷酸序列如seq?idno.3所示。

4、優(yōu)選地，抗mmp9納米抗體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，其核苷酸序列如seqid?no.4所示。

5、優(yōu)選地，gdf5基因是以genbank號(hào)為add39552.1的基礎(chǔ)上優(yōu)化獲得的。

6、優(yōu)選地，抗mmp9納米抗體是通過常規(guī)的納米抗體制備方法制備獲得的。

7、本發(fā)明的另一個(gè)方面是，提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，具體步驟包括：

8、s1、制備間充質(zhì)干細(xì)胞：取含有原代間充質(zhì)干細(xì)胞的胎盤、臍帶或骨髓組織，剪取小塊，在培養(yǎng)皿上用磷酸鹽緩沖液清洗至洗液透明后，充分剪碎；將剪碎的組織轉(zhuǎn)移至50ml離心管，加入25ml質(zhì)量/體積濃度為0.1％的膠原酶iv，放在37℃恒溫箱搖晃消化30min；向消化好的組織中加入20ml磷酸鹽緩沖液，混勻后經(jīng)100μm篩網(wǎng)過濾，濾液于4℃離心機(jī)中1200轉(zhuǎn)/min離心5min，去上清保留細(xì)胞沉淀；向細(xì)胞沉淀中加入5ml的20％的胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，混勻后接種至細(xì)胞瓶，于37℃，5％co2中培養(yǎng)，每隔2天換液一次，進(jìn)行傳代；

9、s2、構(gòu)建慢病毒載體；根據(jù)seq?id?no.3和seq?id?no.4的核苷酸序列直接合成gdf5和抗mmp9納米抗體核苷酸序列，連接入酶切慢病毒表達(dá)載體gv367(agei/nhei酶切，元件順序ubi-mcs-sv40-egfp-ires-puromycin)，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化dh5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，保存構(gòu)建成功的質(zhì)粒；將處于對(duì)數(shù)期的293t細(xì)胞進(jìn)行消化制成細(xì)胞懸液并接種于24孔培養(yǎng)板上，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率約70-80％時(shí)，采用質(zhì)粒dna、包裝質(zhì)粒phelper1.0載體、包膜質(zhì)粒phelper2.0載體和lipofectamine?3000共轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，培養(yǎng)6h后，更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72h后收集富含慢病毒的293t細(xì)胞上清液，進(jìn)行過濾、離心、濃縮后獲得高滴度病毒濃縮液；

10、s3、取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5代以內(nèi)的mscs，以100000個(gè)細(xì)胞/孔接種于12培養(yǎng)板中，每孔1ml培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度約為50％時(shí)移除培養(yǎng)基，再用pb?s洗滌后轉(zhuǎn)染步驟s2的病毒濃縮液，轉(zhuǎn)染時(shí)間為10h。轉(zhuǎn)然后更換培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，按常規(guī)方法進(jìn)行傳代。采用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選7d，每2d換液一次，獲得穩(wěn)定表達(dá)gdf5和抗mmp9納米抗體的mscs。

11、本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，具體是應(yīng)用于治療關(guān)節(jié)炎，聯(lián)合gdf5和mmp9兩個(gè)靶點(diǎn)，將gdf5和抗mmp9納米抗體修飾至間充質(zhì)干細(xì)胞，可以減輕關(guān)節(jié)炎的癥狀從而治療關(guān)節(jié)炎。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

13、本發(fā)明首次將gdf5和抗mmp9納米抗體修飾至間充質(zhì)干細(xì)胞，其中g(shù)df5不僅可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，還可以與mmp9一起，同時(shí)作為治療關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)，提高了治療效果。

技術(shù)特征：

1.一種間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞是通過gdf5基因和抗mmp9納米抗體進(jìn)行雙修飾獲得。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，所述的gdf5基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，所述的抗mmp9納米抗體的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其特征在于，所述的間充質(zhì)干細(xì)胞來源于胎盤、臍帶或骨髓組織。

5.一種權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的gdf5的氨基酸序列如seq?idno.1所示，核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的抗mmp9納米抗體的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

8.權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是制備治療關(guān)節(jié)炎的藥物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的關(guān)節(jié)炎是由自身免疫反應(yīng)、感染、代謝紊亂、創(chuàng)傷、退行性疾病引起的。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨性關(guān)節(jié)炎。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物藥物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因修飾的間充質(zhì)干細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過采用GDF5基因和抗MMP9納米抗體對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行修飾，不僅提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性，還減少了關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)，減輕了關(guān)節(jié)炎所導(dǎo)致疼痛，有效治療關(guān)節(jié)炎。

技術(shù)研發(fā)人員：王翔,韋燕,何詠欣
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州通識(shí)生物醫(yī)藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30