本發(fā)明屬于微生物分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從馬腸道中分離得到的能降解透明質(zhì)酸鈉的糖苷水解酶。

背景技術(shù)：

1、碳水化合物在自然界中以多種形式存在，從蛋白質(zhì)的連接聚糖到植物、真菌和細(xì)菌的細(xì)胞壁，以及淀粉和糖原等儲存聚合物。動物體內(nèi)的碳水化合物降解與其腸道微生物有著密切的關(guān)系，它們所缺乏的能降解碳水化合物的酶，大部分都存在于腸道微生物中[wardman,?j.f.,?bains,?r.k.,?rahfeld,?p.?et?al.?carbohydrate-active?enzymes(cazymes)?in?the?gut?microbiome.?nat?rev?microbiol?20,?542–556?(2022)]。盡管大多數(shù)已知的工業(yè)酶都是通過純培養(yǎng)分離和篩選從微生物中獲得的，但最近的估計表明，環(huán)境中99%以上的微生物無法通過常規(guī)微生物學(xué)方法培養(yǎng)。因此，近年來宏基因組學(xué)的出現(xiàn)提供了一種強(qiáng)有力的工具，可以獲取任何環(huán)境中微生物的遺傳和代謝多樣性，繞過當(dāng)前依賴培養(yǎng)方法的局限性[pabbathi?npp,?velidandi?a,?tavarna?t,?et?al.?role?ofmetagenomicsin?prospecting?novel?endoglucanases,?accentuating?functionalmetagenomics?approach?in?second-generationbiofuel?production:?a?review.biomass?convers?biorefin.?2023;13(2):1371-1398.]，有利于發(fā)現(xiàn)腸道微生物中的潛在碳水化合物酶。在之前的一項研究中，我們使用了宏基因組測序來證實(shí)馬盲腸微生物群是參與復(fù)雜碳水化合物降解的未知酶的重要來源[li?c,?li?x,?guo?r,?et?al.?expandedcatalogue?of?metagenome-assembledgenomes?reveals?resistome?characteristicsand?athletic?performance-associated?microbes?in?horse. microbiome.?2023;11(1):7.?published?2023?jan?12.]。因此，利用宏基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)和挖掘馬盲腸微生物群編碼的cazymes至關(guān)重要。

2、人們對cazymes?的興趣越來越大，據(jù)目前為止，在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(cazy,?www.cazy.org)中，人們已發(fā)現(xiàn)189個糖苷水解酶（ghs），137個糖基轉(zhuǎn)移酶(gts)，43個多糖裂解酶(pls)，和20個碳水化合物酯酶(ce)?,17個輔助酶家族(aas),和103個碳水化合物結(jié)合模塊(cbms)，他們廣泛應(yīng)用于食品加工、工業(yè)生產(chǎn)、生物燃料、環(huán)境治理等多個領(lǐng)域[wardman,?j.f.,?bains,?r.k.,?rahfeld,?p. et?al.carbohydrate-active?enzymes(cazymes)?in?the?gut?microbiome. nat?rev?microbiol20,?542–556?(2022)]。

3、本技術(shù)從馬腸道中分離得到了一種能高效降解透明質(zhì)酸該的糖苷水解酶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是發(fā)掘一種新型高效的碳水化合物酶。

2、為了達(dá)到上述的技術(shù)效果，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：

3、一種來源于馬腸道的能夠降解透明質(zhì)酸鈉的糖苷水解酶，其特征在于：其氨基酸序列為?seq?id?no.1。

4、所述糖苷水解酶的氨基酸序列seq?id?no.1如下：

5、miqsynenrgqqfpfdvviptdeknskfvgtvvthvrrrmpeagtiyivtkrilfdkikryvhdddwqlidentmvaglsfsevfgylkkkgcdsvnkvgwyfqqflklafaltsyckgyyltwdsdtlpiselhffqdgqplftmkkeyhrpyfntlqrligldktssksfiaehmifkpefvcemieeisqntlpgknwvekiiqacdfdyeehcfsefetygtfctvrypgyygeqtlntfragslirgryvndfiierlssdvdiasfeiydamfpydiekriyiwksrwkrltnlspsqalgliwrrifkk。

6、一種來源于馬腸道的能夠降解透明質(zhì)酸鈉的糖苷水解酶重組表達(dá)載體，其特征在于，將上述的能夠降解透明質(zhì)酸鈉的糖苷水解酶的核苷酸序列插入到大腸桿菌表達(dá)載體中得到的表達(dá)能夠降解透明質(zhì)酸鈉的糖苷水解酶的重組表達(dá)載體。

7、所述大腸桿菌表達(dá)載體為119-pet-32a。

8、一種重組菌株，其特征在于：將權(quán)利要求2或3所得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，篩選得到。

9、所述大腸桿菌為de3。

10、一種制備權(quán)利要求1所述的來源于馬腸道的能夠降解透明質(zhì)酸鈉的糖苷水解酶的方法，其特征在于：包括如下步驟：

11、a、馬盲腸內(nèi)容物的采集、馬盲腸內(nèi)容物的測序及組裝、生物信息學(xué)篩選新型碳水化合物酶候選基因、對候選目的基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析并篩選候選目的基因bfc119；

12、b、糖苷水解酶重組表達(dá)載體的構(gòu)建；

13、c、糖苷水解酶蛋白的原核表達(dá)；

14、d、糖苷水解酶蛋白的純化即得到糖苷水解酶。

15、本發(fā)明利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選得到候選蛋白bfc119基因，并通過原核表達(dá)及純化得到候選蛋白bfc119，經(jīng)過實(shí)驗驗證發(fā)現(xiàn)bfc119具有降解透明質(zhì)酸鈉的能力，在腸道中，其分解產(chǎn)物n-乙酰葡糖胺能夠提高阿克曼氏菌的豐度，能夠促進(jìn)減肥和提高免疫力。

16、一種新型碳水化合物酶的發(fā)掘，它包括以下步驟：馬盲腸內(nèi)容物的采集、馬盲腸內(nèi)容物的測序及組裝、生物信息學(xué)篩選新型碳水化合物酶候選基因、對候選目的基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析并篩選候選目的基因、碳水化合物酶基因bfc119的原核表達(dá)及純化、碳水化合物酶基因bfc119的酶活測定、碳水化合物酶基因bfc119家族成員的預(yù)測。其具體步驟如下：

17、馬盲腸內(nèi)容物的采集：在屠宰場采集新鮮的馬盲腸內(nèi)容物，裝在50ml離心管中，液氮中保存。

18、馬盲腸內(nèi)容物的測序及組裝：將馬盲腸內(nèi)容物樣品送至公司測序，利用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行組裝，得到宏基因組組裝基因組（mag）。

19、生物信息學(xué)篩選新型碳水化合物酶候選基因：利用cazy和pul等開源的生信分析工具對宏基因組組裝基因組（mag）進(jìn)行碳水化合物酶注釋及預(yù)測，篩選新型碳水化合物酶。

20、對候選目的基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析并篩選候選目的基因：利用swiss-model等各種在線網(wǎng)站對候選基因bfc119進(jìn)行各種理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測。

21、碳水化合物酶基因bfc119的原核表達(dá)及純化：利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)候選蛋白bfc119，通過親和層析純化得到bfc119的純蛋白。

22、碳水化合物酶基因bfc119的酶活測定：利用dns法驗證候選蛋白119的碳水化合物酶活性。

23、碳水化合物酶基因bfc119家族成員的預(yù)測：利用blastp比對馬盲腸蛋白質(zhì)庫及nr數(shù)據(jù)庫。

24、本發(fā)明更近一步的技術(shù)方案，所述的新型碳水化合物酶bfc119能夠高效降解透明質(zhì)酸鈉，并產(chǎn)生n-乙酰葡糖胺。

25、本發(fā)明利用生物信息學(xué)對馬盲腸宏基因組組裝基因組中挖掘新型的碳水化合物酶家族，篩選得到候選的新型碳水化合物酶基因bfc119，然后通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，利用親和層析的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，利用bradford法測得目的蛋白濃度為0.478mg/ml，通過水楊酸法（dns）測定目的蛋白119的酶活，發(fā)現(xiàn)目的蛋白119的降解底物是透明質(zhì)酸鈉，并產(chǎn)生n-乙酰葡糖胺，酶活力為62.8?u，比活力為2.09?u/mg。

26、本發(fā)明旨在豐富現(xiàn)有的碳水化合物酶基因庫，同時提高木質(zhì)纖維素的利用效率，以及開發(fā)新型高效的酶制劑。本發(fā)明發(fā)掘得到一種新型高效的碳水化合物酶，其對透明質(zhì)酸鈉具有高效的降解能力，為提高對碳水化合物的利用效率，以及開發(fā)新型高效的酶制劑奠定了研究基礎(chǔ)，同時產(chǎn)生的n-乙酰葡糖胺具有提高益生菌豐度的作用，在醫(yī)療、食品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用前景。

27、本發(fā)明與現(xiàn)有發(fā)明相比，具有以下的有益效果：

28、1，本發(fā)明的碳水化合物酶來源于馬盲腸，與化學(xué)合成類產(chǎn)品相比，具有天然無毒害作用的特點(diǎn)；

29、2，本發(fā)明利用生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)掘新型碳水化合物酶，通過實(shí)驗證明了其能高效降解透明質(zhì)酸鈉，并且其產(chǎn)物為n-乙酰葡糖胺，n-乙酰葡糖胺能夠促進(jìn)腸道益生菌阿克曼氏菌的生長，具有減肥和提高免疫力的作用；