本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)和腫瘤學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種肝癌相關(guān)抗原afp的淋巴細胞抗原表位肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、據(jù)國家癌癥中心最新發(fā)布的2022年中國惡性腫瘤疾病負擔(dān)情況顯示，我國2022年肝癌新發(fā)病例位居第4，死亡病例位居第3，肝癌的高發(fā)與高致死率。原發(fā)性肝癌的病理類型，主要是肝細胞癌，占到85％～90％，傳統(tǒng)治療方法和療效都有限且總體預(yù)后差。

2、在我國，hcc的高危人群主要有乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒感染、長期酗酒、非酒精脂肪性肝炎、食用黃曲霉毒素污染的食物、多種原因引起的肝硬化以及有肝癌家族史的人群，同時，年齡40歲以上的男性風(fēng)險較大。近年的研究提示糖尿病、肥胖和吸煙等也是hcc的危險因素，值得關(guān)注。

3、甲胎蛋白是常見的一種在肝癌中存在過表達的腫瘤相關(guān)抗原，在肝癌的診斷、治療、病程監(jiān)測等發(fā)面被廣泛研究。血清afp陽性，是指afp≥400μg，且排除慢性或活動性肝炎、肝硬化、睪丸或卵巢胚胎源性腫瘤以及妊娠等，高度懷疑肝癌。afp低度升高者，應(yīng)進行動態(tài)觀察，并與肝功能變化對比分析。約30％的肝癌患者afp水平正常，應(yīng)檢測甲胎蛋白異質(zhì)體。本專利選用肝癌相關(guān)腫瘤抗原afp進行研究。

4、細胞毒性t細胞是介導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細胞，在抗感染、抗腫瘤以及超敏反應(yīng)和自身免疫病的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，其細胞膜上的t細胞受體能夠特異性識別并結(jié)合抗原遞呈細胞表面mhc?i類分子與抗原肽的復(fù)合物，即mhc/抗原肽復(fù)合體分子。ctl表位是指與mhc?i類分子結(jié)合的抗原肽，是抗原分子中能被tcr特異性識別的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu)，是引起免疫應(yīng)答反應(yīng)的基本抗原單位，在ctl活化過程中扮演著關(guān)鍵角色。

5、mhc系統(tǒng)指主要組織相容性復(fù)合體，是脊椎動物基因組中一組緊密連鎖的基因群，編碼表達mhc?i類和ii類蛋白分子。hla是人類的mhc系統(tǒng)，負責(zé)將抗原肽提呈給t細胞，啟動機體的特異性免疫應(yīng)答。其中hla-a、b、c等i類分子提呈抗原肽激活cd8+t細胞，分化為ctls，是靶向殺傷腫瘤細胞的主要效應(yīng)細胞。然而，hla等位基因在人群中呈高度多態(tài)性。不同個體之間，hla分子并不完全相同，每種hla分子所能提呈的抗原肽序列也有很多差異，引起的t細胞免疫反應(yīng)也強弱不同。因此，同一腫瘤抗原在不同個體內(nèi)引起的特異性免疫應(yīng)答強弱不同。對于人類肝癌而言，hla?i類分子主要負責(zé)將內(nèi)源性肝癌相關(guān)抗原呈遞給cd8+ctl，活化的ctls通過分泌穿孔素和顆粒酶等使表達腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤細胞凋亡。因此，動態(tài)監(jiān)測肝癌相關(guān)抗原特異性cd8+t細胞的數(shù)量和功能可以準確反映肝癌患者針對肝癌相關(guān)抗原的特異性免疫功能狀態(tài)。由于不同人的hla分子型別不同，其對肝癌不同抗原的加工、處理和提呈能力也不相同，從而引起不同強度的肝癌相關(guān)抗原特異性t細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)。根據(jù)肝癌患者不同的hla分子型別，選擇其所提呈的肝癌相關(guān)抗原的抗原肽，動態(tài)監(jiān)測該肝癌相關(guān)抗原特異性的cd8+t細胞的數(shù)量和反應(yīng)活性，對肝癌患者的疾病進程監(jiān)測、診斷與治療方案的制定、療效觀察和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的判斷等都有重要意義，是實現(xiàn)肝癌精準醫(yī)學(xué)治療的重要技術(shù)手段。同時，利用這些hla-a分子高親和力結(jié)合的肝癌相關(guān)抗原的抗原肽，還可以制備多肽疫苗或基因疫苗，預(yù)防和治療肝癌。

6、但是，目前已明確的被各種hla分子所提呈并能刺激機體引起t細胞應(yīng)答反應(yīng)的afp特異性t細胞表位仍然極少，從而限制了對攜帶不同hla等位基因的肝癌患者開展afp特異性t細胞檢測，也限制了肝癌afp特異性t細胞在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究，更限制了基于hla基因個體差異性及其提呈的肝癌afp抗原肽差異性的個性化檢測和精準免疫治療。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出了一種肝癌相關(guān)抗原afp的淋巴細胞抗原表位肽及其應(yīng)用。

2、本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

3、本發(fā)明的第一方面，涉及一種肝癌相關(guān)抗原afp的淋巴細胞抗原表位肽，所述表位肽的氨基酸序列包括以下任意一種或多種：

4、gegaadiii；

5、上述氨基酸序列單個氨基酸的去除或者更換后的氨基酸序列。

6、本發(fā)明的第二方面，涉及上述的肝癌相關(guān)抗原afp的淋巴細胞抗原表位肽在制備肝癌疫苗中的應(yīng)用。

7、本發(fā)明的第三方面，涉及一種編碼上述的肝癌相關(guān)抗原afp的淋巴細胞抗原表位肽的核酸分子。

8、本發(fā)明的第四方面，涉及一種含有上述核酸分子的載體。

9、本發(fā)明的第五方面，涉及一種用于治療或者預(yù)防肝癌的疫苗，含有上述的核酸分子或上述的載體。

10、本發(fā)明的第六方面，涉及上述的肝癌相關(guān)抗原afp的淋巴細胞抗原表位肽在制備用于治療或預(yù)防肝癌的藥物中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明的第七方面，涉及上述的肝癌相關(guān)抗原afp的淋巴細胞抗原表位肽在制備肝癌相關(guān)抗原afp?t細胞的試劑盒中的應(yīng)用。

12、可選地，所述試劑盒包括：所述檢測試劑為酶聯(lián)免疫斑點法試劑、胞內(nèi)細胞因子熒光染色法試劑、酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑、人類白細胞抗原多聚體熒光染色或流式細胞分析法試劑。

13、本發(fā)明的第八方面，涉及一種單克隆抗體，能夠特異性結(jié)合上述的表位肽。

14、本發(fā)明的第九方面，涉及一種用于治療肝癌的藥物，包括上述的單克隆抗體。

15、更具體地說，本發(fā)明提供了新的肝癌相關(guān)抗原afp的淋巴細胞抗原表位肽，其氨基酸序列為如下所示：

16、

17、從上述的表格可看出，上述序列為甲胎蛋白的抗原肽序列，并分別與hla-a2402、hla-a0201、hla-a3303等分子呈高親和力結(jié)合，在抗原提呈細胞表面組成“hla/抗原肽”復(fù)合體分子，與afp抗原肽特異性cd8+t細胞克隆結(jié)合，刺激其活化、增殖和分化，發(fā)揮抗肝癌免疫效應(yīng)作用。

18、肝癌相關(guān)抗原afp的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列可用于制備肝癌多肽疫苗或基因疫苗：多肽疫苗制備：按照本發(fā)明的多肽序列人工合成一種或多種多肽，與佐劑混合制成可溶性制劑，或者由生物納米材料裝載制成納米多肽疫苗，注入肝癌患者體內(nèi)，激發(fā)肝癌患者afp特異性t細胞活化、增殖，并增強其殺瘤細胞活性，從而制備成肝癌多肽疫苗?；蛞呙缰苽洌喊凑毡景l(fā)明的多肽序列，構(gòu)建一種多肽或多種多肽的重組dna基因片段、重組質(zhì)粒或者重組病毒載體，注入肝癌患者體內(nèi)，使該重組基因在體內(nèi)表達一種或多種多肽，激發(fā)肝癌患者afp特異性t細胞活化、增殖，并增強其殺瘤細胞活性，從而制備成肝癌基因疫苗。

19、肝癌相關(guān)抗原afp的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列可用于制備檢測肝癌相關(guān)抗原afp特異性t細胞的檢測制劑或試劑盒：按照本發(fā)明的多肽序列，人工合成一種或多種多肽，在酶聯(lián)免疫斑點法、胞內(nèi)細胞因子熒光染色法和酶聯(lián)免疫吸附試驗中，作為抗原制劑，與患者外周血單個核細胞混合培養(yǎng)，刺激afp特異性t細胞活化、增殖和分泌細胞因子，進而通過其他組合試劑檢測該細胞因子的合成量，從而反應(yīng)afp特異性t細胞的數(shù)量和反應(yīng)活性；也可以利用這些多肽通過基因工程技術(shù)和蛋白工程技術(shù)制備人類白細胞抗原與多肽的復(fù)合體及其多聚體，再進一步制備成熒光素標(biāo)記的制劑，用流式細胞分析法檢測患者外周血單個核細胞群中afp特異性t細胞的數(shù)量。相關(guān)試劑盒則是指由上述制劑與不同檢測方法中常用的其他試劑組裝而成的肝癌相關(guān)抗原afp特異性t細胞檢測試劑盒。

20、肝癌相關(guān)抗原afp的胸腺依賴性淋巴細胞抗原表位肽序列可用于制備治療肝癌的藥物：將上述基于本發(fā)明多肽序列的多肽疫苗或基因疫苗與其他免疫治療制劑或化學(xué)治療制劑組合，制備成治療肝癌的臨床藥物。

21、本發(fā)明利用六種在線表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫虛擬預(yù)測13種hla-a分子限制性的肝癌相關(guān)抗原afp特異性抗原表位肽序列，獲得一組能分別與hla-a0201、hla-a1101、hla-a2402、hla-a3101、hla-a0206、hla-a0207、hla-a3303、hla-a3001、hla-a0203、hla-a1102、hla-a0301、hla-a0101、hla-a2601分子呈高親和力結(jié)合的肝癌相關(guān)抗原afp表位肽序列，然后通過胞內(nèi)細胞因子染色功能性實驗驗證了其免疫原性，為制備肝癌治療和預(yù)防性疫苗以及研制肝癌afp特異性t細胞檢測試劑等提供了特異性抗原肽。

22、1.選擇甲胎蛋白氨基酸序列為靶向序列；

23、2.選擇預(yù)測結(jié)果獲得研究者公認的、具有較高準確性的、常用的六種表位預(yù)測數(shù)據(jù)庫：syfpeithi、bimas、svmhc、iedb、netmhc和epijen預(yù)測上述13種hla-a分子限制性的afp抗原表位肽序列；

24、3.根據(jù)一定的預(yù)測標(biāo)準，對六個在線表位預(yù)測網(wǎng)站的預(yù)測結(jié)果進行整合分析，獲得六個網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果較一致的候選抗原肽序列。

25、4.通過ifn-γics細胞功能性實驗驗證肝癌相關(guān)抗原肽afp的免疫原性。

26、5.通過表達特定hla分子的hmy2.cir細胞株進行hla-a分子的多肽競爭結(jié)合實驗，分析陽性表位肽與特定hla-a分子結(jié)合力。

27、6.通過免疫hla轉(zhuǎn)基因小鼠驗證陽性表位肽在體內(nèi)刺激特異性t細胞活化增值的免疫原性。

28、本發(fā)明為甲胎蛋白中能分別與hla-0201、hla-0301、hla-1101、hla-2402、hla-1102、hla-0207、hla-3001、hla-3101分子呈高親和力結(jié)合并且具有免疫原性的抗原肽序列；還涉及到以上述抗原肽為基礎(chǔ)的肝癌多肽疫苗、基因疫苗，以及以上述抗原肽為基礎(chǔ)的檢測肝癌afp特異性t細胞的試劑和方法。

29、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點如下：

30、本發(fā)明通過在線虛擬預(yù)測和功能性實驗驗證獲得的hla-0201、hla-0301、hla-1101、hla-2402、hla-1102、hla-0207、hla-3001、hla-3101分子限制性的肝癌相關(guān)抗原afp特異性抗原表位肽以前沒有被報道過。這些hla-a分子以前也沒有被報道有限制性的肝癌相關(guān)抗原肽。因此這些新的抗原表位肽序列將為研制針對肝癌治療性和預(yù)防性多肽疫苗和基因疫苗、設(shè)計檢測肝癌afp特異性t細胞的試劑和方法等提供所需的關(guān)鍵抗原組分，即抗原表位肽序列；同時這些抗原表位肽也為針對這些特定hla-a等位基因的肝癌患者進行個體化檢測和精準醫(yī)療提供了關(guān)鍵的抗原組分。