本技術(shù)涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有核糖環(huán)結(jié)構(gòu)的galnac化合物，由其制備的galnac綴合的寡核苷酸，可實(shí)現(xiàn)高效肝靶向遞送。

背景技術(shù)：

1、核酸藥物尤其是寡核苷酸藥物，由于其合成簡單、活性較高而得到廣泛應(yīng)用。寡核苷酸藥物通常包括反義寡核苷酸(aso)、小干擾rna(sirna)、微小rna(mirna)和核酸適配體等。

2、寡核苷酸是一類短的dna或rna分子、寡聚體，寡核苷酸很容易以序列特異性的方式與它們各自的互補(bǔ)寡核苷酸、dna或rna結(jié)合，形成雙鏈體，或者更不常見的是更高階的雜合體。這種基本特性使得寡核苷酸在基因檢測、靶向基因治療的研究和醫(yī)藥學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用。這些小片段的核酸可以制造為具有任何指定序列的單鏈分子。在自然界中，寡核苷酸通常是在基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起作用的小rna分子，或者是源自較大核酸分子分解的降解中間體。

3、rna干涉是一個(gè)針對外源基因的自然防御機(jī)制。sirna能夠通過對特定序列的識(shí)別并分解目標(biāo)mrna的方式敲除目標(biāo)基因。

4、n-乙酰半乳糖胺(galnac)，是一種與肝表面去唾液酸糖蛋白受體(asgpr)結(jié)合的配體。去唾液酸糖蛋白受體是肝細(xì)胞表面特異性表達(dá)的一種內(nèi)吞型受體。近年來，利用asgpr的高親和性配體galnac作為靶向分子，在核酸藥物的肝靶向遞送方面取得了一定的進(jìn)展。例如，阿爾尼拉姆公司(pharmaceuticals,inc.)報(bào)道了基于galnac綴合技術(shù)的sirna在小鼠體內(nèi)發(fā)揮基因沉默活性(nair?jk,et?al.j.am.chem.soc.2014,136,16958)。文中報(bào)道了galnac與sirna的綴合物，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均展現(xiàn)了良好的遞送活性。通過皮下給藥的小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，單一劑量的ed50確定為1mg/kg，單次注射劑量小于1ml。在長期給藥實(shí)驗(yàn)中，每周皮下注射一次，可獲得長達(dá)9個(gè)月的穩(wěn)定干擾活性。研究發(fā)現(xiàn)，四觸角和三觸角galnac化合物，對asgpr的親和力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于雙觸角和單觸角galnac化合物。

5、結(jié)構(gòu)不同的galnac化合物，對核酸遞送效果差別很大。為了提高對肝靶向藥物，例如agt抑制劑類藥物、抗慢性乙肝感染藥物、降血脂類藥物的遞送效果，本領(lǐng)域有開發(fā)新的galnac化合物的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種含有核糖環(huán)或其衍生結(jié)構(gòu)的galnac單體及其在小核酸藥物肝靶向遞送中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的galnac化合物能夠用于制備galnac綴合的寡核苷酸，遞送效率明顯提升，并顯著抑制agt基因表達(dá)。

2、本發(fā)明提供了一種式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

3、

4、其中，

5、r1為氧或硫；

6、r2為氫、c1-6烷基、c1-6烷氧基或鹵素；

7、r3為氫、羥基保護(hù)基、含磷活性反應(yīng)基團(tuán)、-co(ch2)xconh-或-co(ch2)xcooh，其中x是1-10的整數(shù)，為可控孔玻璃或聚苯乙烯；

8、r4為氫或羥基保護(hù)基；

9、a為-(ch2)a-、-(ch2ch2och2ch2)b-或-(ch2och2)c-，其中，a是1-10的整數(shù)；b是1-5的整數(shù)；c為1-7的整數(shù)；

10、l為-conh-或-nhco-；

11、g為

12、其中，

13、t為羥基用?；Ｗo(hù)的：n-乙酰-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、n-縮甲醛-半乳糖胺、n-丙酰-半乳糖胺和n-丁酰-半乳糖胺；

14、x1為-(ch2)f-或-(ch2ch2o)fch2-，f是1-5的整數(shù)；

15、x2為-(ch2)g-，g是1-6的整數(shù)；

16、y1為0或1；

17、y2為0、1或2；

18、y3為1、2或3；

19、m為0-4的整數(shù)；

20、n為0-4的整數(shù)。

21、某一方案中，所述式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽中；某些基團(tuán)的定義可如下所述，其他基團(tuán)的定義可如上任一方案所述(以下簡稱“某一方案中”)：

22、某一方案中，所述c1-6烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基或叔丁基。

23、某一方案中，所述c1-6烷氧基為甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基或叔丁氧基。

24、某一方案中，所述鹵素為氟、氯或溴。

25、某一方案中，a為-ch2ch2och2ch2-、-(ch2)2-、-(ch2)3-、-(ch2)4-或-(ch2)5-。

26、某一方案中，r1為氧。

27、某一方案中，r1為α構(gòu)型或β構(gòu)型，例如α構(gòu)型。

28、某一方案中，r2為c1-6烷氧基，例如-och3。

29、某一方案中，r3中，所述羥基保護(hù)基為?；?、硅基、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、4,4'-雙甲氧基三苯甲基，優(yōu)選為乙酰基、1,1,3,3-四異丙基二硅氧烷基、叔丁基二甲基硅基、二甲基苯基硅基、4,4'-雙甲氧基三苯甲基。

30、某一方案中，r3為含磷活性反應(yīng)基團(tuán)，所述含磷活性反應(yīng)基團(tuán)例如為

31、某一方案中，r3為含磷活性反應(yīng)基團(tuán)、-co(ch2)xconh-為可控孔玻璃(cpg)或聚苯乙烯，優(yōu)選地，x為2。

32、某一方案中，r3為-co(ch2)2conh-為可控孔玻璃(cpg)。

33、某一方案中，r3為-co(ch2)2cooh。

34、某一方案中，r4為羥基保護(hù)基，優(yōu)選為三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基或4,4'-雙甲氧基三苯甲基，更優(yōu)選為4,4'-雙甲氧基三苯甲基。

35、某一方案中，t為?；Ｗo(hù)的n-乙酰-半乳糖胺，所述?；蔀橐阴；虮郊柞；?，例如乙酰基。

36、某一方案中，x1為-(ch2)f-，f優(yōu)選為1。

37、某一方案中，a為2-7的整數(shù)。

38、某一方案中，b為1-3的整數(shù)。

39、某一方案中，g為2。

40、某一方案中，y1為0。

41、某一方案中，y2為0。

42、某一方案中，y3為1。

43、某一方案中，m為0，1或2，例如1。

44、某一方案中，n為0，1或2，例如0。

45、某一方案中，其中l(wèi)為-nhco-。

46、某一方案中，其中g(shù)為

47、

48、某一方案中，所述式(i)化合物為下式i-1所示化合物；

49、

50、其中，r2、r3、r4、a和x2獨(dú)立地如本發(fā)明任一方案所述。某一方案中，所述式(i)所示的化合物為如下任一化合物：

51、

52、

53、某一方案中，所述式(i)所示的化合物為如下任一化合物：

54、

55、

56、為可控孔玻璃(cpg)。

57、某一方案中，所述式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽能夠結(jié)合脫唾液酸糖蛋白受體(asgpr)。

58、本發(fā)明提供了一種上述式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為中間體在制備galnac綴合的寡核苷酸藥物的應(yīng)用。

59、本發(fā)明提供了一種綴合物，其包含寡核苷酸和galnac部分；寡核苷酸和galnac通過磷酸酯基或硫代磷酸酯基連接(通過r3-1或r4-1連接)；所述galnac部分為一個(gè)或多個(gè)galnac分子，其通過磷酸酯基或硫代磷酸酯基連接形成；其中，所述galnac分子為式(i)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽；

60、

61、其中，r3-1為連接鍵，r4為h；

62、或者，r4-1為連接鍵，r3-1為h；

63、g為

64、t1為為n-乙酰-半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、n-縮甲醛-半乳糖胺、n-丙酰-半乳糖胺和n-丁酰-半乳糖胺，優(yōu)選為n-乙酰-半乳糖胺；

65、y3、y2、x2、y1、x1、m、n、r2、r1、a、l如本發(fā)明任一方案所述。

66、某一方案中，所述綴合物中，所述寡核苷酸可包括非硫代寡核苷酸和硫代寡核苷酸。

67、某一方案中，所述綴合物中，所述非硫代寡核苷酸和所述galnac部分可通過磷酸酯鍵連接。

68、某一方案中，所述綴合物中，所述硫代寡核苷酸和所述galnac部分可通過硫代磷酸酯鍵連接。

69、某一方案中，所述綴合物優(yōu)選如下所示結(jié)構(gòu)：

70、

71、其中，oligo代表寡核苷酸，x3為氧或硫，q為1、2或3；

72、r1、r2、r3、r4、a、l、g、m和n獨(dú)立地如本發(fā)明任一方案所述。

73、某一方案中，所述綴合物中，其中所述寡核苷酸優(yōu)選包括小干擾核苷酸(sirna)、dna、微小rna(mirna)、小激活rna(sarna)、小向?qū)na(small?guide?rna,sgrna)、轉(zhuǎn)運(yùn)rna(trna)、反義核苷酸(aso)或適配體(aptamer)，優(yōu)選為反義核苷酸(aso)或小干擾核苷酸(sirna)。

74、某一方案中，所述綴合物中，其中所述反義核苷酸(aso)或小干擾核苷酸(sirna)中每個(gè)核苷酸優(yōu)選各自獨(dú)立地為修飾或未修飾的核苷酸。

75、某一方案中，所述綴合物優(yōu)選具有如下所示結(jié)構(gòu)：

76、

77、

78、

79、所述綴合物中，其中寡核苷酸調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。

80、本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明任一方案所述的綴合物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。

81、本發(fā)明提供了一種本發(fā)明任一方案所述的綴合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或本發(fā)明任一方案所述藥物組合物在制備用于治療和/或預(yù)防由肝組織中或病毒中特定基因的表達(dá)而引起的病理狀況或疾病的藥物中的用途；可選地，所述特定基因選自乙型肝炎(hbv)病毒基因、前蛋白轉(zhuǎn)換酶枯草溶菌素9(pcsk9)基因、凝血因子基因、脂蛋白a基因、血管生成素樣蛋白3基因、血管緊張素原基因或者載脂蛋白c3基因等。優(yōu)選地，所述疾病選自慢性肝病、肝炎、肝纖維化疾病、肝增生性疾病和心腦血管疾病；可選地，所述心腦血管疾病為高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、動(dòng)脈粥樣硬化或凝血功能障礙等。

82、本發(fā)明提供了一種抑制肝細(xì)胞中特定基因表達(dá)的方法，其中，所述方法包括向有需要個(gè)體施用將治療有效量的前述任一項(xiàng)所述的綴合物，優(yōu)選地，所述方法包括將有效量的前述任一項(xiàng)所述的綴合物與所述肝細(xì)胞進(jìn)行接觸；可選地，所述特定基因選自前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9基因(pcsk9)、乙型肝炎病毒基因、載脂蛋白a基因、凝血十一因子基因、血管生成素樣蛋白3基因、血管緊張素原基因或者載脂蛋白c3基因。

83、本發(fā)明提供了一種試劑盒，該試劑盒包括本發(fā)明任一方案所述的綴合物。

84、術(shù)語解釋:

85、術(shù)語“藥學(xué)上可接受”是指相對無毒、安全、適合于患者使用。

86、術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指化合物與藥學(xué)上可接受的酸或堿反應(yīng)得到的鹽。當(dāng)化合物中含有相對酸性的官能團(tuán)時(shí)，可以通過在合適的惰性溶劑中用足量的藥學(xué)上可接受的堿與化合物接觸的方式獲得堿加成鹽。當(dāng)化合物中含有相對堿性的官能團(tuán)時(shí)，可以通過在合適的惰性溶劑中用足量的藥學(xué)上可接受的酸與化合物接觸的方式獲得酸加成鹽。具體可參見handbook?of?pharmaceutical?salts:properties,selection,and?use(p.heinrich?stahl,camille?g.wermuth,2011,2nd?revised?edition)。

87、術(shù)語“酰基”是指r-co-，其中r為c1-6烷基、c6-14芳基或被取代的c1-6烷基、被取代的c6-14芳基，取代基可以是鹵素、氰基、羥基或c6-14芳基。

88、所有術(shù)語治療有效量是指在給予受試者時(shí)足以有效治療本文所述的疾病或病癥的化合物的量。雖然構(gòu)成“治療有效量”的化合物的量將根據(jù)化合物、病癥及其嚴(yán)重度、以及欲治療受試者的年齡而變化，但可由本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)方式確定。

89、所有術(shù)語受試者、個(gè)體、有需要個(gè)體是指根據(jù)本公開的實(shí)施例，即將或已經(jīng)接受了該綴合物或藥物組合物給藥的任何動(dòng)物，哺乳動(dòng)物為優(yōu)，人類最優(yōu)。如本文所用所有術(shù)語“哺乳動(dòng)物”包括任何哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的實(shí)例包括但不限于牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猴、人等，以人類為最優(yōu)。

90、在某些實(shí)施例中，治療或正在治療是指疾病或病癥或其至少一個(gè)可辨別癥狀的改善、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)。在另一些實(shí)施例中，治療或正在治療是指正在治療的疾病或病癥的至少一個(gè)可測量身體參數(shù)的改善、預(yù)防或逆轉(zhuǎn)，可能并未在哺乳動(dòng)物中識(shí)別所述疾病或病癥。然而在另一個(gè)實(shí)施例中，治療或正在治療是指減慢疾病或病癥的進(jìn)展，或者是身體上的，例如可辨別癥狀的穩(wěn)定，或生理學(xué)上的，例如，身體參數(shù)的穩(wěn)定，或兩者兼而有之。在另一些實(shí)施例中，治療或正在治療是指延遲疾病或病癥的發(fā)作。

91、在某些實(shí)施例中，本公開的化合物可作為預(yù)防措施給藥。如本文所用，“預(yù)防”或“正在預(yù)防”是指降低獲得給定疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。在實(shí)施例的優(yōu)選模式中，將指定化合物作為預(yù)防措施給予受試者，例如有癌癥或自身免疫性疾病家族病史或傾向的受試者。

92、在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

93、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

94、本技術(shù)提供的galnac化合物及由其制備的galnac綴合的寡核苷酸具有如下一個(gè)或多個(gè)有益效果：

95、1.本技術(shù)設(shè)計(jì)了一系列新型galnac化合物，與現(xiàn)有技術(shù)galnac化合物相比，化學(xué)結(jié)構(gòu)完全不同。

96、2.由本技術(shù)設(shè)計(jì)的galnac化合物制備的galnac綴合的寡核苷酸，與由現(xiàn)有技術(shù)galnac化合物(例如l96和yk-gal-325)制備的galnac綴合的寡核苷酸相比，遞送效率顯著提升，對小鼠血清中agt蛋白表達(dá)抑制率和肝臟中agt?mrna水平抑制率顯著提升。