本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，涉及煙葉提質(zhì)的微生物加工領(lǐng)域，具體本發(fā)明涉及一種葡萄牙棒孢酵母菌。同時(shí)，本發(fā)明還涉及所述葡萄牙棒孢酵母菌的分離方法和其在發(fā)酵煙葉改善煙葉香氣質(zhì)量的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、煙葉香氣特征是品質(zhì)形成的重要影響因素，品質(zhì)較差的醇化煙葉香氣量少，吃味平淡，過分深暗，香氣量不足且香氣質(zhì)差，刺激性與雜氣較重。醇化煙葉內(nèi)淀粉、蛋白、果膠與纖維素等大分子物質(zhì)含量高是抽吸時(shí)產(chǎn)生雜氣的原因，不同品質(zhì)煙葉香氣特征存在差異。

2、微生物用于煙葉提質(zhì)的原理主要包括通過發(fā)酵過程改善煙葉的化學(xué)成分和香氣特征。微生物發(fā)酵是一種有效的煙葉提質(zhì)技術(shù)，它通過利用特定的微生物菌種對煙葉進(jìn)行處理，以改善煙葉的品質(zhì)。這一過程涉及多個(gè)方面，包括優(yōu)化煙葉的化學(xué)成分、增加香氣物質(zhì)的種類和含量，以及減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生。通過選擇合適的微生物菌種和發(fā)酵條件，可以調(diào)整煙葉中的基本化學(xué)成分，如調(diào)整煙葉的ph值、水分含量等，從而使煙葉更加適合制作煙草產(chǎn)品。例如，解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的發(fā)酵過程中，通過控制發(fā)酵條件如接菌量、糖鹽溶液濃度、發(fā)酵溫度和時(shí)間，可以優(yōu)化煙草原料的發(fā)酵工藝，從而改善煙葉的化學(xué)成分。微生物發(fā)酵能夠促進(jìn)煙葉中致香物質(zhì)的產(chǎn)生和積累。通過發(fā)酵過程，可以增加醛、酮、酯等具有香氣的物質(zhì)的種類和相對含量，同時(shí)減少刺激性物質(zhì)的產(chǎn)生，從而使煙葉的香氣更加濃郁、和諧，減少刺激性，提升煙葉的整體品質(zhì)。研究表明解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵煙葉后增加了9種致香物質(zhì)，減少了7種刺激性物質(zhì)，而枯草芽孢桿菌發(fā)酵煙葉后增加了6種醇類和酮類物質(zhì)，減少了5種物質(zhì)，從而使得煙葉的香味更加復(fù)雜濃烈、刺激性小、滋味豐富。在煙葉發(fā)酵和醇化過程中，通過人為添加有益微生物和微生物酶類，可以調(diào)控?zé)熑~內(nèi)部的化學(xué)成分，發(fā)揮煙葉微生物的價(jià)值。如通過添加特定的微生物菌種進(jìn)行發(fā)酵處理，可以有效提高煙葉的安全性。

3、目前微生物技術(shù)在改善煙葉品質(zhì)的應(yīng)用主要集中于細(xì)菌，而真菌作為改善茶葉、可可、咖啡、酒類等發(fā)酵制品品質(zhì)的優(yōu)良菌株，其具備生長活性強(qiáng)、功能特性穩(wěn)定等特性，在改善醇化煙葉品質(zhì)中的應(yīng)用較少。因此篩選一株高效改善煙葉香氣質(zhì)量的功能真菌對于提升煙葉品質(zhì)具有重要意義。

4、為了解決以上問題，提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的葡萄牙棒孢酵母菌。本發(fā)明的目的還在于提供所述葡萄牙棒孢酵母菌在卷煙生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的葡萄牙棒孢酵母菌y-3為首次被分離得到，經(jīng)鑒定為微生物新種，目前未有任何關(guān)于所述葡萄牙棒孢酵母菌y-3及相關(guān)應(yīng)用的公開報(bào)道。

2、本發(fā)明提供了一種改善煙葉香氣質(zhì)量的酵母菌及其應(yīng)用，涉及煙葉提質(zhì)的微生物加工領(lǐng)域，本發(fā)明還涉及酵母菌在發(fā)酵煙葉改善煙葉香氣質(zhì)量的應(yīng)用。具體的，本發(fā)明提供了一種葡萄牙棒孢酵母菌y-3，以及所述葡萄牙棒孢酵母菌y-3的分離、培養(yǎng)的方法以及其用于發(fā)酵煙葉的用途。該菌株來源于巴西煙葉，屬于公認(rèn)安全菌株，可以用作生物制劑制備與卷煙加工。菌株單菌落呈乳白色，表面光滑不透明，邊緣整齊，該菌株容易培養(yǎng)與保存。經(jīng)菌種鑒定該酵母菌物種信息為葡萄牙棒孢酵母菌，命名為clavispora?lusitaniae?y-3，于2024年3月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏地址為中國武漢大學(xué)，菌株保藏編號為cctcc?no：m?2024473。使用常規(guī)真菌富集培養(yǎng)基(ypd/pda)富集菌株，發(fā)酵液具有清香特征，使用煙葉制備培養(yǎng)基富集菌株，發(fā)酵液具有水果甜香特征，煙香特征更加柔和細(xì)膩。該菌株制備的菌液發(fā)酵醇化煙葉后可改善煙葉香氣質(zhì)與香氣量。

3、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的。

4、本發(fā)明第一方面涉及一種葡萄牙棒孢酵母菌，其微生物學(xué)分類命名為葡萄牙棒孢酵母菌y-3，拉丁文學(xué)名為clavispora?lusitaniae?y-3，已于2024年3月14日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號為cctcc?no：m?2024473。

5、本發(fā)明所分離得到的葡萄牙棒孢酵母菌y-3的its基因核苷酸序列如序列表所示。

6、本發(fā)明分離、培養(yǎng)如本發(fā)明第一方面所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3的方法，包括以下步驟：

7、稱取巴西烤煙30g至100ml無菌水中，置于30℃搖床中以160r/min震蕩60min，使得煙葉中微生物充分溶解于無菌水中獲得菌懸液。將得到的懸液作倍比稀釋10-1、10-2、10-3、10-4等4個(gè)梯度，從原液及四種稀釋過后的共5種濃度離心管中吸取200ul液體涂布至pda固體培養(yǎng)基上。隨后置30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不定期觀察菌落生長情況。挑選單菌落繼續(xù)劃線直至獲得干凈、單一的菌落。y-3菌株的菌落形態(tài)圖如圖1，該菌株單菌落呈乳白色，表面光滑不透明。

8、上述分離、培養(yǎng)如本發(fā)明第一方面所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3的方法，pda固體培養(yǎng)基，組成如下：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂15g、蒸餾水100ml。

9、將y-3菌株從平板上接種至常規(guī)pda液體培養(yǎng)基中，置于30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，每間隔3h進(jìn)行取樣，吸取1ml菌液至離心管中，并檢測其od600值，繪制菌株生長曲線確定菌株生長過程中達(dá)到對數(shù)期、穩(wěn)定期、衰亡期的時(shí)間，以確定其生長特性。

10、上述分離、培養(yǎng)如本發(fā)明第一方面所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3的方法，常規(guī)pda液體培養(yǎng)基，組成如下：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水100ml。

11、本發(fā)明將所得菌種送至上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行菌種鑒定。

12、本發(fā)明第二方面涉及一種菌劑，其活性成分為本發(fā)明第一方面所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3。

13、本發(fā)明第三方面涉及一種本發(fā)明第一方面所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3或者本發(fā)明第二方面所述的菌劑在卷煙生產(chǎn)的應(yīng)用。

14、優(yōu)選地，所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3或所述的菌劑用于發(fā)酵煙葉，以改善煙葉香氣質(zhì)量，提高煙葉香氣質(zhì)與香氣量。

15、本發(fā)明具有以下有益效果：

16、1.本發(fā)明從巴西煙葉樣品中分離得到的純培養(yǎng)菌株中，篩選得到一株新菌株y-3，經(jīng)形態(tài)學(xué)研究、生理生化分析、分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明該菌株為微生物新種，屬于葡萄牙棒孢酵母菌，微生物學(xué)分類命名為葡萄牙棒孢酵母菌y-3，拉丁文學(xué)名為clavisporalusitaniae?y-3，于2024年3月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，保藏地址為中國武漢大學(xué)，菌株保藏編號為cctcc?no：m?2024473。

17、2.使用常規(guī)真菌富集培養(yǎng)基(ypd)富集菌株，發(fā)酵液具有清香特征，使用煙葉制備培養(yǎng)基富集菌株，發(fā)酵液具有水果甜香特征，煙香特征更加柔和細(xì)膩。該菌株制備的菌液發(fā)酵醇化煙葉后可改善煙葉香氣質(zhì)與香氣量，降低刺激性與雜氣。

18、3.本發(fā)明菌株來源于巴西煙葉，屬于公認(rèn)安全菌株，可以用作生物制劑制備與卷煙加工。

19、4.本發(fā)明菌株容易培養(yǎng)與保存。

技術(shù)特征：

1.一種葡萄牙棒孢酵母菌，其特征在于，其微生物學(xué)分類命名為葡萄牙棒孢酵母菌y-3，拉丁文學(xué)名為clavispora?lusitaniae?y-3，已于2024年3月14日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，其保藏編號為cctcc?no：m?2024473。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葡萄牙棒孢酵母菌，其特征在于，所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3的its序列如序列表seq?id?no.1所示。

3.一種菌劑，其特征在于，其活性成分為權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3。

4.一種權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3或權(quán)利要求3所述的菌劑在卷煙生產(chǎn)的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，其特征在于，所述的葡萄牙棒孢酵母菌y-3或所述的菌劑用于發(fā)酵煙葉，以改善煙葉香氣質(zhì)量。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種葡萄牙棒孢酵母菌，其微生物學(xué)分類命名為葡萄牙棒孢酵母菌Y?3，拉丁文學(xué)名為Clavispora?lusitaniae?Y?3，于2024年3月14日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址為中國武漢大學(xué)，菌株保藏編號為CCTCC?NO：M?2024473。本發(fā)明還公開了所述葡萄牙棒孢酵母菌Y?3的分離、培養(yǎng)的方法以及其用于發(fā)酵煙葉的用途。使用常規(guī)真菌富集培養(yǎng)基(YPD)富集菌株，發(fā)酵液具有清香特征，使用煙葉制備培養(yǎng)基富集菌株，發(fā)酵液具有水果甜香特征，煙香特征更加柔和細(xì)膩。該菌株制備的菌液發(fā)酵醇化煙葉后可改善煙葉香氣質(zhì)與香氣量。

技術(shù)研發(fā)人員：李正風(fēng),黎娟,夏玉珍,秦天,夭建華,張仁東,夏建軍,蘇楊,朱杰,鄭博文,王蘿萍,錢穎穎,趙文軍,馬翔,徐濟(jì)倉,劉欣,劉馨芮彤,郭丁榮
受保護(hù)的技術(shù)使用者：云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6