本發(fā)明涉及獸用生物制品領域，尤其涉及一種大腸桿菌基因缺失株及構(gòu)建方法、應用、疫苗。

背景技術(shù)：

1、大腸桿菌是大腸埃希氏菌的俗稱，屬于腸桿菌科、埃希氏菌屬的成員，首次是由德國科學家entero，bacteriaceae在1885年借助于顯微鏡于嬰兒的糞便中分離得出，到20世紀中期，相關學者才開始發(fā)現(xiàn)有一些特殊血清型的大腸桿菌對于動物以及人類是具有致病性的，自然界中大腸桿菌的血清型很多，但絕大多數(shù)為動物和人類腸道正常菌群，對腸道生理功能具有一定的調(diào)節(jié)作用，僅小部分血清型具有致病性，通常對于幼齡畜種以及兒童表現(xiàn)為嚴重的腹瀉和敗血癥，肺炎、泌尿道感染等。大腸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，無莢膜，大多數(shù)菌株的運動方式為周生鞭毛運動，兩端鈍圓，存在方式為成對或散在分布；兼性厭氧菌，可以在普通培養(yǎng)基上良好生長，經(jīng)過37℃，ph在7.2至7.4之間，培養(yǎng)18至24小時可形成光滑、濕潤且邊緣整齊、淺灰色、透明的菌落；在沙門、志賀菌屬瓊脂培養(yǎng)基(ss)上一般生長較差或不生長，生長者可呈紅色菌落；在伊紅美藍瓊脂上生長會產(chǎn)生黑色帶有金屬亮光的菌落特征；

2、在營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長旺盛，使肉湯培養(yǎng)基高度渾濁，搖晃易散開；生化反應較為活潑，v-p試驗呈陰性、吲哚和m.r試驗均為陽性、不能利用丙二酸鈉和枸櫞酸鹽、不液化明膠、不產(chǎn)生尿素酶、苯丙氨酸脫氫酶和硫化氫、不能在氰化鉀培養(yǎng)基上生長。

3、并且apec感染家禽常以氣囊炎、肝周炎、心包炎、腫頭、呼吸道纖維素性滲出為主要特征性病癥。嚴重時可導致全身性菌血癥、產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋下降、肉雞死淘率上升，并常與其他禽類呼吸系統(tǒng)疾病形成混合感染，加重病情，造成嚴重經(jīng)濟損失。近年來在畜禽養(yǎng)殖業(yè)“減抗、限抗”的大環(huán)境下，apec的發(fā)病率有所上升，并且apec毒力因子眾多，免疫機制復雜，傳統(tǒng)的滅活疫苗制備和使用繁瑣，不能適應臨床需求，且由于抗原漂移容易導致免疫失敗。利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)制備apec減毒活疫苗，可為該病防控提供有效的技術(shù)手段。

4、在細菌中，調(diào)節(jié)性非編碼rna(regulatorynon-codingrna)通常被稱為小rna(srna)。這類rna分子的大小通常在50～300nt之間，它們絕大多數(shù)不編碼蛋白質(zhì)，而是作為rna調(diào)節(jié)子，對細菌在特定環(huán)境下的基因表達發(fā)揮調(diào)節(jié)功效；而hfq在srna的調(diào)控作用中，尤其是在反式調(diào)控(trans-action)中起著重要的媒介作用，是目前已知的最重要的srna結(jié)合蛋白之一。雖然目前對hf?q的具體作用機制還不完全清楚，但是已有的數(shù)據(jù)表明，hfq至少在翻譯的進行和rna的穩(wěn)定性方面起著重要作用。在翻譯層面上hfq主要具有正負兩種調(diào)控方式。第1種方式(負向調(diào)控)：靶標mrna本來能夠正常翻譯，hfq和調(diào)控該mrna的srna結(jié)合后，作用于mrna的核糖體結(jié)合位點(ribosome－bindi?ngsite，rbs)上，阻止核糖體就位，從而阻礙翻譯正常進行；另外，一些靶標mrna5'非翻譯區(qū)上的堿基能夠自我互補配對，形成的二級結(jié)構(gòu)掩蓋了核糖體結(jié)合位點，阻礙mrna翻譯。hfq的第2種作用方式(正向調(diào)控)：hfq先與調(diào)控靶標mrna的srna形成復合體，該復合體可以打開mrna5'非翻譯區(qū)上的二級結(jié)構(gòu)，從而使得核糖體結(jié)合位點暴露出來，激活被抑制的mrna，促使翻譯能夠正常進行。

5、中國專利申請202011402244.4公開了一種禽大腸桿菌疫苗株，該大腸桿菌疫苗株為通過去除aroa基因制備的弱毒株，該弱毒株保持了流行毒株大腸桿菌o78株所具備的天然的免疫原性，同時毒性明顯致弱，能用于制備活疫苗。

6、佛山科學技術(shù)學院的李榮旭在其碩士學位論文《鵝源鼠傷寒沙門菌crp、hf?q基因缺失株構(gòu)建及其生物學與免疫特性測定》對鵝源鼠傷寒沙門菌的hfq基因進行敲除，該方案以ncbi獲得的鼠傷寒沙門菌lt2株全基因序列(nc_003197.2)，以之為參考模板，設計引物hfq-cm-f、hfq-cm-r，其中hfq-cm-f的核苷酸序列為ttggtgaatggtattaagctgcaaggtcaaatcgagtccttta?ttgcagcattacacgtc，hfq-cm-rttggtgaatggtattaagctgcaaggt?caaatcgagtcctttattgcagcattacacgtc，該方案通過上述引物結(jié)合red同源重組技術(shù)對hfq基因進行敲除，得到缺失hfq基因的a29δcrp株，并在后續(xù)的試驗過程中發(fā)現(xiàn)，a29δhfq的毒力較野生型菌株下降202.2倍，由此可見，上述方案能夠給予我們的技術(shù)啟示是，對鵝源鼠傷寒沙門菌中hfq基因的敲除能夠在一定的程度上降低鵝源鼠傷寒沙門菌的毒力。

7、本方案需要解決的問題：如何提供一種毒力較弱且對部分抗生素的抗性極弱的禽致病性大腸桿菌基因缺失株。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的是提供一種毒力較弱且對氨芐霉素、卡那霉素不具有抗性的禽致病性大腸桿菌基因缺失株。

2、本技術(shù)不作特殊說明的情況下：nm代表納摩爾/升，um代表微摩爾/升，mm代表毫摩爾/升，m代表摩爾/升；

3、為實現(xiàn)上述目的，本技術(shù)公開了一種禽致病性大腸桿菌基因缺失株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

4、步驟1：根據(jù)ncbi網(wǎng)站上公布的hfq基因序列設計引物組，所述引物組包括上游引物hfq-kan-f、下游引物hfq-kan-r，所述上游引物hfq-kan-f的核苷酸序列如seq?id?no：1所示，所述下游引物hfq-kan-r的核苷酸序列如seq?id?no：2所示；

5、步驟2：通過red重組技術(shù)以pkd4質(zhì)粒為模板結(jié)合步驟1得到的引物組得到用于敲除hfq基因的打靶dna片段；

6、步驟3：將步驟2制得的打靶dna片段導入禽致病性大腸桿菌內(nèi)，并依次置于含卡那霉素、含氨芐霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)后挑選同時不具有氨芐霉素、卡那霉素的轉(zhuǎn)換子，得到禽致病性大腸桿菌基因缺失株。

7、優(yōu)選地，步驟3中，將敲除hfq基因后的pkd4質(zhì)粒導入禽致病性大腸桿菌的方法為電轉(zhuǎn)化法，電轉(zhuǎn)化過程中的參數(shù)為1.8kv，2.0ma，3.0ms。

8、優(yōu)選地，含氨芐霉素的培養(yǎng)基中，氨芐霉素的濃度為100μg/ml；

9、含卡那霉素的培養(yǎng)基中，卡那霉素的濃度為50μg/ml。

10、此外，本技術(shù)還公開了一種禽致病性大腸桿菌基因缺失株，通過上述的禽致病性大腸桿菌基因缺失株的構(gòu)建方法制得。

11、優(yōu)選地，所述禽致病性大腸桿菌基因缺失株對鏈霉素、磺胺異惡唑、四環(huán)素的抗性不高于2μg/ml。

12、此外，本技術(shù)還公開了一種如上所述的禽致病性大腸桿菌基因缺失株作為禽致病性大腸桿菌疫苗活性成分的用途。

13、此外，本技術(shù)還公開了一種禽致病性大腸桿菌疫苗，含有上述的禽致病性大腸桿菌基因缺失株。

14、本技術(shù)的有益效果是：

15、本技術(shù)通過打靶dna片段對禽致病性大腸桿菌中hfq基因的敲除，獲得了一株不含抗性基因標記的apec基因工程毒力致弱株，并為該細菌引起的疾病的預防以及疫苗的制備提供了有效的技術(shù)手段，并且，通過試驗可見，該毒力致弱株(大腸桿菌基因缺失株)對親本株具有顯著的免疫保護效果。