本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種共表達(dá)trim11和apoe2的核酸序列構(gòu)建體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、癡呆癥是一種綜合癥，可以由多種疾病引起，這些疾病會(huì)隨著時(shí)間的推移破壞神經(jīng)細(xì)胞并損害大腦，通常會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能(即處理思維的能力)退化，記憶力、思想、行為和社會(huì)技能持續(xù)下降，這些變化會(huì)影響個(gè)人自理能力。目前，全世界有超過5500萬人患癡呆癥，其中60％以上生活在低收入和中等收入國(guó)家。每年有近1000萬新病例。癡呆癥是由影響大腦的各種疾病和損傷引起的。阿爾茨海默病(alzheimer’s?disease，ad)是癡呆癥最常見的形式，可能占病例數(shù)的60-70％，并且隨著年齡的增長(zhǎng)，患病的風(fēng)險(xiǎn)也在增加。

2、阿爾茨海默病為一種神經(jīng)退化的疾病，有將近七成的風(fēng)險(xiǎn)因子與遺傳有關(guān)；其他的風(fēng)險(xiǎn)因子還有頭部外傷、憂郁癥和高血壓等。ad的癥狀包括記憶障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)以及視空間能力損害等。此外，患者的抽象思維和計(jì)算力也會(huì)損害，常伴隨人格和行為的改變。

3、阿爾茨海默病的真正成因至今仍然不明。有很多假說嘗試去解釋ad的發(fā)病機(jī)理，如aβ級(jí)聯(lián)假說、膽堿能假說、tau蛋白異常磷酸化假說、神經(jīng)炎癥假說和金屬離子紊亂假說等。ad大腦神經(jīng)病理學(xué)改變的特征包括，aβ蛋白沉積形成的淀粉樣蛋白斑，神經(jīng)原纖維纏結(jié)(過度磷酸化tau蛋白組成的胞內(nèi)聚集體)，突觸的喪失、萎縮、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)(例如乙酰膽堿)的選擇性耗竭以及路易體(少數(shù)情況)，以上這些情況導(dǎo)致了神經(jīng)元之間的信息交流障礙甚至神經(jīng)元的死亡，最終導(dǎo)致ad。其中β-淀粉樣蛋白(aβ)沉積假說和異常磷酸化tau蛋白假說是最經(jīng)典的病理和假說。

4、目前并沒有可以阻止或逆轉(zhuǎn)病程的治療，只有少數(shù)方法或許可以暫時(shí)緩解或改善癥狀，目前的藥物開發(fā)思路主要是圍繞清除β-淀粉樣蛋白(aβ)，調(diào)節(jié)tau蛋白，以及乙酰膽堿酯酶抑制劑(ache)等這些熱門的領(lǐng)域。

5、最近科學(xué)家對(duì)tripartite?motif(trim)蛋白家族的研究發(fā)現(xiàn)了幾種trim分子具有阻止tau聚集的強(qiáng)大能力，他們發(fā)現(xiàn)其中trim11的表達(dá)水平在阿爾茨海默病大腦中顯著下調(diào)。并且，其表達(dá)水平和tau聚集之間存在很強(qiáng)的負(fù)相關(guān)性，在高表達(dá)trim11的大腦中，tau聚集水平較低，反之亦然。進(jìn)一步的機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)trim11可以對(duì)有缺陷的tau蛋白和過量正常的tau蛋白進(jìn)行蛋白酶體降解，從而將tau蛋白與泛素蛋白酶體途徑聯(lián)系起來。trim11還可以作為阻止tau錯(cuò)誤折疊和聚集的分子伴侶，以及發(fā)揮tau蛋白解聚酶的作用，分解已經(jīng)形成的tau蛋白聚集體。trim11可防止細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的自發(fā)性和誘導(dǎo)性的聚集，使tau蛋白保持可溶性狀態(tài)。因此，trim11是一種重要的神經(jīng)保護(hù)因子。

6、apoe基因編碼的蛋白質(zhì)稱為載脂蛋白(apolipoprotein?e)，它在體內(nèi)有多種功能，其中之一是參與脂質(zhì)代謝和膽固醇運(yùn)輸。apoe有3種常見的等位基因(e2、e3、e4),它們的區(qū)別在于apoe基因水平上兩個(gè)位點(diǎn)的改變，反應(yīng)到蛋白層面就是這兩個(gè)位點(diǎn)(第112個(gè)氨基酸和第158個(gè)氨基酸)究竟是半胱氨酸還是精氨酸，如果一條染色體上編碼得到的apoe兩個(gè)位點(diǎn)都是cys，這條染色體就是apoe2型，如果第112號(hào)位是cys，而第158號(hào)位是arg，那么這個(gè)載脂蛋白就是apoe3，兩個(gè)都是arg，那就是apoe4。3種等位基因可以組合成為6種基因型，apoe2/2，2/3，2/4，3/3，3/4和4/4，從而編碼三種apoe蛋白異構(gòu)體，分別為apoe2、apoe3和apoe4。ad與該基因的多態(tài)性密切相關(guān)。apoe3純合人群的ad發(fā)病率設(shè)為基準(zhǔn)，含有apoe4人群的ad發(fā)病率均高于apoe3純合人群的，兩種雜合含e4/e2和e4/e3患病概率分別是apoe3純合的2.6和3.6倍；而純的e4/e4的ad發(fā)病率則猛增到15.5倍。e2則能降低ad的發(fā)病概率。

7、基因治療是應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理論和實(shí)踐的新興治療方法，是極具發(fā)展?jié)摿Φ纳镝t(yī)藥領(lǐng)域之一，未來發(fā)展前景可觀。基于aav的基因療法作為一種非常具有前景的替代方案受到大家積極地推崇，最近的臨床實(shí)驗(yàn)也成功地凸顯了其實(shí)用性。lx1001是lexeo?therapeutics公司開發(fā)的一種基于aav的在研基因療法，旨在將表達(dá)保護(hù)性apoe2的轉(zhuǎn)基因遞送到攜帶兩個(gè)apoe4等位基因的阿爾茨海默病患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)，以阻止或減緩疾病進(jìn)展。2022年2月，公布了lx1001在治療apoe4純合子ad患者的1/2期臨床試驗(yàn)中獲得積極數(shù)據(jù)。從臨床數(shù)據(jù)中顯示，在一次治療后并隨訪超過12個(gè)月的兩名患者中，腦脊液中的tau蛋白水平和磷酸化tau蛋白水平與基線相比顯著降低，未觀察到嚴(yán)重安全性和耐受性問題。最近科學(xué)家用aav將trim11遞送到多種tau蛋白病小鼠模型的大腦中。發(fā)現(xiàn)trim11顱內(nèi)遞送可有效防止tau蛋白的病理形成和神經(jīng)炎癥。除此之外，trim11還可以有效防止認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能下降。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明提供了一種共表達(dá)trim11和apoe2的重組腺相關(guān)病毒載體，實(shí)現(xiàn)了trim11蛋白和apoe2蛋白的共表達(dá)，同時(shí)下調(diào)tau蛋白和β樣蛋白?？梢杂糜谥委煱柶澓ＤY藥物的研發(fā)過程。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種核酸序列構(gòu)建體，其特征在于，包括復(fù)合序列，所述復(fù)合序列由編碼三螺旋結(jié)構(gòu)蛋白11(trim11)和人載脂蛋白e2(apoe2)的核苷酸序列，連接編碼兩個(gè)蛋白的核苷酸序列之間的自加工單元序列(apu)組成。

4、優(yōu)選地，所述三螺旋結(jié)構(gòu)蛋白11的氨基酸序列入seq?id?no.1所示；所述人載脂蛋白e2的氨基酸序列如seq?id?no.3所示；所述的自加工單元序列，包含但不限于內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(ires)，編碼2a肽或類2a肽的序列，intein、b型細(xì)菌體intein樣結(jié)構(gòu)域(bil)、furin序列及其衍生物。

5、優(yōu)選地，所述復(fù)合序列中的自加工單元序列2a肽或類2a肽，包含但不限于源于手足口病毒的f2a、源于馬甲型鼻炎病毒的e2a、源于豬捷申病毒的p2a和源于明脈扁刺蛾病毒的t2a。

6、優(yōu)選地，所述復(fù)合序列中的自加工單元序列為源于豬捷申病毒的p2a。

7、優(yōu)選地，所述復(fù)合序列的核苷酸序列具有如seq?id?no.7～11任一項(xiàng)所示核苷酸序列的核酸。

8、本發(fā)明中所述的復(fù)合序列，還可以是具有如seq?id?no.7～11所述序列中任意的片段中取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸的核酸；或者與所述核酸的序列至少具有85％的同源性，且編碼trim11(seq?id?no.1)和apoe2(seq?id?no.3)蛋白的核酸；或者與上述任一項(xiàng)部分互補(bǔ)或完全互補(bǔ)的核酸。

9、本發(fā)明還提供了一種真核表達(dá)載體，包含所述的seq?id?no.7～11任一項(xiàng)所示核苷酸序列的核酸。

10、優(yōu)選地，所述載體為病毒，非病毒，裸dna中的一種。

11、優(yōu)選地，所述非病毒載體選自納米載體、高分子載體中的一種，如陽(yáng)離子多聚物載體、脂質(zhì)體載體和納米顆粒載體等，通過包裹所述的核苷酸序列構(gòu)建體，將其遞送到目標(biāo)細(xì)胞和組織中表達(dá)；所述病毒載體選自慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體中至少一種。

12、優(yōu)選地，所述腺相關(guān)病毒載體的血清型包含但不限于aav1、aav2、aav4、aav5、aav8、aav9、php.eb和aav-retro。

13、本發(fā)明還提供了一種所述的核酸序列構(gòu)建體，或者所述的真核表達(dá)載體在制備治療癡呆癥藥物中的應(yīng)用。

14、本發(fā)明中的核苷酸序列構(gòu)建體可以通過體內(nèi)途徑和體外途徑給藥，實(shí)現(xiàn)目的基因在目標(biāo)細(xì)胞和組織中的表達(dá)，將目的基因在體外導(dǎo)入人體自身或異體細(xì)胞(或異種細(xì)胞)，經(jīng)體外細(xì)胞擴(kuò)增后，再回輸?shù)襟w內(nèi)?；蛘邔⑺龅暮塑账嵝蛄醒b配到特定的真核表達(dá)載體，直接導(dǎo)入體內(nèi)，這種載體可以是病毒或非病毒，甚至是裸dna。所述的病毒、非病毒載體或裸dna的給藥途徑包含但不限于靜脈注射全身給藥、顱內(nèi)或鞘內(nèi)注射給藥。

15、本發(fā)明提供的核苷酸序列構(gòu)建體，將編碼trim11蛋白的序列和編碼載脂蛋白apoe的序列通過自加工單元(以p2a為例)連接，構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒載體paav-3×flag-trim11-p2a-apoe2-ha(wt)，主要的構(gòu)建思路為：通過p2a連接trim11基因和apoe2基因，其中trim11通過促進(jìn)tau蛋白的sumo化和蛋白酶體降解，防止tau蛋白的錯(cuò)誤折疊和聚集，同時(shí)還能作為解聚酶溶解已存在的tau聚集物。載脂蛋白apoe2是一種帶有信號(hào)肽的分泌蛋白，可以與aβ結(jié)合，并以脂質(zhì)狀態(tài)和apoe亞型依賴的方式促進(jìn)aβ清除。構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒載體paav-3×flag-trim11-p2a-apoe2-ha(wt)中目的基因的序列示意圖如圖1所示。其中，所述trim11的氨基酸序列信息如下seq?id?no.1所示，編碼所述trim11的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述apoe2的氨基酸序列信息如下seq?id?no.3所示；編碼所述apoe2的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；p2a的氨基酸序列信息如下seq?id?no.5所示，編碼所述p2a的核苷酸序列信息如seq?id?no.6所示。

16、本發(fā)明中的seq?id?no.7～11的序列是通過選取5個(gè)不同的在線密碼子優(yōu)化平臺(tái)：gensmart、idt、geneart，vectorbuilder和tsingke，對(duì)我們的trim11-p2a-apoe2基因進(jìn)行優(yōu)化，然后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)通過idt、geneart和vectorbuilder(vb)優(yōu)化的序列，表達(dá)量明顯提高，其中vertorbuilder優(yōu)化的效果最好，優(yōu)化后的trim11的表達(dá)量是野生型的1.91倍，apoe2是野生型的2.57倍。

17、研究發(fā)現(xiàn)，aβ通過激活jnk激酶，促進(jìn)tau蛋白的過度磷酸化和蛋白積累，另一方面，tau蛋白也能抑制aβ蛋白的降解，因此aβ和tau毒性可以互作形成一個(gè)滾雪球的環(huán)路進(jìn)而不斷加重ad的進(jìn)程，該機(jī)制提示我們，之前針對(duì)aβ或tau進(jìn)行單靶點(diǎn)的藥物開發(fā)可能并不能有效的抑制ad的進(jìn)程，而將aβ和tau做為合并靶點(diǎn)可能是減慢ad的最有效的方法。因此，本發(fā)明開創(chuàng)性的構(gòu)建了trim11和apoe2的aav表達(dá)載體，并且對(duì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，獲得了細(xì)胞中高效共表達(dá)trim11和apoe2的基因片段，由此構(gòu)建了高效共表達(dá)trim11和apoe2的重組腺相關(guān)病毒載體以及治療阿爾茲海默癥的藥物。實(shí)驗(yàn)表明，攜帶trim11和apoe2的aav病毒能夠直接感染sh-sy5y神經(jīng)母細(xì)胞，在靶細(xì)胞中過表達(dá)攜帶目的基因的aav載體能夠同時(shí)下調(diào)tau蛋白和β-淀粉樣蛋白。

18、本發(fā)明將目的基因trim11和apoe2通過自加工單元(auto-processing?unit，apu)連接，構(gòu)建了核苷酸序列構(gòu)建體，通過western?blot和elisa驗(yàn)證了目的基因trim11和apoe2的表達(dá)，通過共轉(zhuǎn)染tau，發(fā)現(xiàn)tau的表達(dá)跟載體呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，tau的表達(dá)量隨著trim11的表達(dá)下調(diào)，并且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。然后通過不同的密碼子優(yōu)化平臺(tái)對(duì)目的基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，通過western?blot篩選獲得高效表達(dá)的基因片段。用優(yōu)化后的序列構(gòu)建aav載體，包裝純化aav重組病毒，感染神經(jīng)母細(xì)胞sh-sy5y后，驗(yàn)證了目的基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。同時(shí)，序列優(yōu)化后的載體與tau共轉(zhuǎn)染之后，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的載體可以高效的抑制tau的形成。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：本發(fā)明提供的核苷酸序列構(gòu)建體，可以實(shí)現(xiàn)trim11和apoe2的高效共表達(dá)，為治療阿爾茲海默病藥物的研究提供了重要基礎(chǔ)。