本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種脂肪酶a突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、南極假絲酵母脂肪酶a（ candida?antarcticalipase?a，簡稱cala）在脂肪酶研究領(lǐng)域中具有獨特的地位，因其對甘油三酯的sn-2位點具有明顯的偏好性而備受關(guān)注。這種特殊的選擇性使其在生物催化過程中具有重要應(yīng)用價值。與其他類型的脂肪酶相比，cala具有以下幾個顯著的優(yōu)點：（1）溫度穩(wěn)定性：cala在高溫條件下仍能保持其活性，這使得它在工業(yè)應(yīng)用中更為穩(wěn)定；（2）底物特異性：cala能夠有效水解甘油三酸酯，特別是反式不飽和脂肪酸，這在食品工業(yè)和生物燃料生產(chǎn)中具有重大前景；（3）化學選擇性：cala對氨基具有高度的化學選擇性，使其在氨基酸及其衍生物的不對稱合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。除了上述優(yōu)點之外，cala還表現(xiàn)出與南極假絲酵母脂肪酶b（ candida?antarcticalipase?b，簡稱calb）相似的特性，如高溫穩(wěn)定性和對有機溶劑的耐受性。然而，cala在界面活性方面的表現(xiàn)更為突出，這為其在工業(yè)應(yīng)用中提供了更大的潛力。

2、甘油二酯（diacylglycerol，簡稱dag）是一種重要的脂質(zhì)分子，由甘油與兩個游離的脂肪酸分子通過酯化反應(yīng)形成，或者是由甘油三酯（triacylglycerol，簡稱tag）中的一個脂肪酸分子被羥基取代而得到。dag存在兩種不同的立體構(gòu)型：1,2-甘油二酯和1,3-甘油二酯。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，相比于1,2-甘油二酯，富含1,3-甘油二酯的食用油因其獨特的生理活性和健康益處而受到關(guān)注。作為一種新型的功能型油脂，1,3-甘油二酯具有以下顯著的健康功效：（1）預(yù)防和治療脂肪肝；（2）降低心腦血管疾病風險；（3）控制體重，預(yù)防肥胖癥。1,3-甘油二酯的這些特性使其在食品工業(yè)和健康領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。例如，1,3-甘油二酯可以作為健康食品的成分，用于開發(fā)低熱量、高營養(yǎng)價值的食品產(chǎn)品。此外，1,3-甘油二酯在醫(yī)藥領(lǐng)域也有潛在的應(yīng)用，可能用于開發(fā)治療相關(guān)疾病的藥物。

3、但現(xiàn)有的野生型假絲酵母脂肪酶a在制備1,3-甘油二酯時，存在催化活性差、對甘油三酯的sn-2位點的選擇性差等問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種脂肪酶a突變體及其制備方法和應(yīng)用。用于解決現(xiàn)有的野生型假絲酵母脂肪酶a在制備1,3-甘油二酯時，存在催化活性差、對甘油三酯的sn-2位點的選擇性差等問題。

2、具體地，本發(fā)明通過理性設(shè)計，對來源于南極假絲酵母（ candida?antarctica）的脂肪酶a進行定點突變，得到催化活性和對甘油三酯的sn-2位點的選擇性顯著提高的南極假絲酵母脂肪酶a（cala）突變體，并且在制備1,3-甘油二酯時，該cala突變體能顯著提高1,3-甘油二酯的產(chǎn)量。

3、在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種脂肪酶a，其氨基酸序列如seq?id?no:?1所示。

4、本發(fā)明提供的上述脂肪酶a可以是天然、重組或合成的活性多肽，該活性多肽可以是天然純化的產(chǎn)物、化學合成的產(chǎn)物，或是使用重組技術(shù)從原核宿主（例如大腸桿菌）或真核宿主（例如酵母、高等植物）中產(chǎn)生的產(chǎn)物。

5、在一些實施方案中，上述脂肪酶a是通過將含有其編碼基因的重組載體導入表達宿主（例如畢赤酵母gs115）中得到重組基因工程菌株，然后將該重組基因工程菌株進行培養(yǎng)，并進行誘導表達，得到脂肪酶a。

6、在一些實施方案中，本發(fā)明提供一種編碼上述脂肪酶a的核酸分子，其核苷酸序列如seq?id?no:?2所示。

7、本發(fā)明提供的上述核酸分子通?？梢酝ㄟ^pcr擴增或人工合成的方法獲得。

8、在第一方面，本發(fā)明提供了一種脂肪酶a突變體，脂肪酶a突變體是在如seq?idno:?1所示的氨基酸序列的如下至少一個位點：第94位、117位、121位、122位、283位、431位進行一個或幾個氨基酸殘基的變化得到的蛋白質(zhì)；其中，變化選自取代、缺失、添加中的至少一種。

9、在一些實施方案中，脂肪酶a突變體是在如seq?id?no:?1所示的氨基酸序列的如下至少一個位點的突變：1）e94w；2）v117l；3）l121i；4）d122y；5）f283w；6）f431g。

10、在一些實施方案中，脂肪酶a突變體為氨基酸序列如seq?id?no:?3、seq?id?no:5、seq?id?no:?7、seq?id?no:?9、seq?id?no:?11、seq?id?no:?13所示的蛋白質(zhì)。

11、本發(fā)明中，氨基酸序列如seq?id?no:?3所示的脂肪酶a突變體為e94w（脂肪酶a第94位中的谷氨酸(glu)突變?yōu)樯彼?trp)）；氨基酸序列如seq?id?no:?5所示的脂肪酶a突變體為v117l（脂肪酶a第117位中的纈氨酸(val)突變?yōu)榱涟彼?leu)）；氨基酸序列如seqid?no:?7所示的脂肪酶a突變體為l121i（脂肪酶a第121位中的亮氨酸(leu)突變?yōu)楫惲涟彼?ile)）；氨基酸序列如seq?id?no:?9所示的脂肪酶a突變體為d122y（脂肪酶a第122位中的天冬氨酸(asp)突變?yōu)槔野彼?tyr)）；氨基酸序列如seq?id?no:?11所示的脂肪酶a突變體為f283w（脂肪酶a第283位中的苯丙氨酸(phe)突變?yōu)樯彼?trp)）；氨基酸序列如seqid?no:?13所示的脂肪酶a突變體為f431g（脂肪酶a第431位中的苯丙氨酸(phe)突變?yōu)楦拾彼?gly)）。

12、在一些實施方案中，上述脂肪酶a突變體中，除了在第94位、117位、121位、122位、283位、431位中的至少一個位點發(fā)生上述突變之外，其進一步可以在其他位點上具有氨基酸的保守取代，使得突變后的氨基酸比如seq?id?no:1所示的野生型脂肪酶a具有更高的催化效率。優(yōu)選地，氨基酸的保守取代保留本發(fā)明脂肪酶a突變體的較高的催化效率。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言很明顯，這種取代可以在上述位點以外的區(qū)域發(fā)生，而仍保留相應(yīng)活性。優(yōu)選地，保守取代變體具有至少一個位置的氨基酸保守取代。保守取代的實例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代：堿性氨基酸（如精氨酸、賴氨酸和組氨酸）、酸性氨基酸（如谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（如谷氨酰胺、天冬酰胺）、疏水性氨基酸（如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）、芳香氨基酸（如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸），以及小分子氨基酸（如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸）。最常見的氨基酸互換有氨基酸g至a；a至g、s；v至i、l、a、t、s；i至v、l、m；l至i、m、v；m至l、i、v；p至a、s、n；f至y、w、h；y至f、w、h；w至y、f、h；r至k、e、d；k至r、e、d；h至q、n、s；d至n、e、k、r、q；e至q、d、k、r、n；s至t、a；t至s、v、a；c至s、t、a；n至d、q、h、s；q至e、n、h、k、r的互換，以及它們的相反的互換。

13、與上述脂肪酶a突變體的氨基酸序列具有一定的氨基酸同源性的脂肪酶a突變體，優(yōu)選地同源性為70-99%之間，例如可以為70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或這些數(shù)值中的任意二者之間的數(shù)值或者范圍；更優(yōu)選地同源性為80-99%之間，例如可以為80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、96%、98%、99%或這些數(shù)值中的任意二者之間的數(shù)值或者范圍；進一步更優(yōu)選地同源性為90-99%之間，例如可以為90%、92%、94%、96%、98%、99%或這些數(shù)值中的任意二者之間的數(shù)值或者范圍；最優(yōu)選地同源性為99%，也屬于本發(fā)明的保護范圍。

14、本發(fā)明提供的上述脂肪酶a突變體可以是天然、重組或合成的活性多肽，該活性多肽可以是天然純化的產(chǎn)物、化學合成的產(chǎn)物，或是使用重組技術(shù)從原核宿主（例如大腸桿菌）或真核宿主（例如酵母、高等植物）中產(chǎn)生的產(chǎn)物。

15、在一些實施方案中，上述脂肪酶a突變體是通過將含有其編碼基因的重組載體導入表達宿主（例如畢赤酵母gs115）中得到重組基因工程菌株，然后將該重組基因工程菌株進行培養(yǎng)，并進行誘導表達，得到脂肪酶a突變體。

16、在第二方面，本發(fā)明提供了編碼上述任一項脂肪酶a突變體的核酸分子。

17、本發(fā)明提供的上述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；也可以是rna，如mrna或hnrna等；并且該核酸分子通?？梢酝ㄟ^pcr擴增或人工合成的方法獲得。

18、在一些實施方案中，核酸分子選自如下任一所示的核酸分子：a1）具有如seq?idno:?4、seq?id?no:?6、seq?id?no:?8、seq?id?no:?10、seq?id?no:?12、seq?id?no:?14所示的核苷酸序列的核酸分子；a2）與a1）限定的核酸分子在嚴格條件下雜交且編碼上述任一項脂肪酶a突變體的核酸分子；a3）與a1）或a2）限定的核酸分子具有90%以上的序列同一性且編碼上述任一項脂肪酶a突變體的核酸分子。

19、如本文所用，術(shù)語“在嚴格條件下雜交”是指兩個核酸分子片段在如sambrook等的分子克?。簩嶒炇謨?1989)(冷泉巷實驗室出版，紐約，美國)的“大腸桿菌中克隆基因的表達”一節(jié)里所述的標準雜交條件下互相雜交。這樣的條件如在45℃的6.0×ssc中雜交，然后在50℃的2×ssc中進行洗滌的步驟。為了選擇嚴格性，可以例如在用于低嚴格性的50℃下的2.0×ssc和用于高嚴格性50℃下的2.0×ssc之間選擇洗滌步驟中的鹽濃度。另外，洗滌步驟中溫度可在用于低嚴格性的約22℃的室溫和用于高嚴格性的65℃之間變化。

20、如本文所用，術(shù)語“序列同一性”可以用肉眼或計算機軟件（比如ausubel?et?al.eds.（2007）在current?protocols?in?molecular?biology中所述的軟件程序）進行評價。當被比較的序列中的位置被相同的堿基或氨基酸占據(jù)時，則分子在該位置是同一的。兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。多聚核苷酸序列或氨基酸序列與另一序列具有一定百分比（例如90%、95%、98%或者99%）的“序列同一性”是指當序列比對時，所比較的兩個序列中該百分比的堿基或氨基酸相同。

21、在第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，其包含上述核酸分子。

22、本發(fā)明中的重組載體包括克隆載體和表達載體，克隆載體用于復制相關(guān)序列，表達載體用于表達相關(guān)基因，其中構(gòu)建表達載體時用到的載體可以為phbm905bdm載體。

23、在第四方面，本發(fā)明提供了一種重組細胞，其包含上述核酸分子或上述重組載體。

24、在一些實施方案中，重組細胞的制備方法包括將上述重組載體轉(zhuǎn)化至表達宿主細胞中的步驟。

25、在第五方面，本發(fā)明提供了一種脂肪酶a突變體的制備方法，包括如下步驟：對上述重組細胞進行培養(yǎng)，經(jīng)誘導表達，得到培養(yǎng)物；從上述培養(yǎng)物中分離上述脂肪酶a突變體。

26、本發(fā)明中，培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒有特殊要求，保證重組細胞正常生長即可。并且從培養(yǎng)物中分離出上述脂肪酶a突變體的方法均是本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

27、在一些實施方案中，脂肪酶a突變體的制備方法中所使用的培養(yǎng)基是本領(lǐng)域內(nèi)可表達蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，優(yōu)選bmmy培養(yǎng)基。

28、在第六方面，本發(fā)明提供了如上述脂肪酶a突變體、上述核酸分子、上述重組載體、上述重組細胞或上述制備方法制備得到的脂肪酶a突變體在制備1,3-甘油二酯中的應(yīng)用。

29、在第七方面，本發(fā)明提供了一種1,3-甘油二酯的制備方法，包括如下步驟：將上述脂肪酶a突變體、上述重組細胞或上述制備方法制備得到的脂肪酶a突變體作為催化劑，催化大豆油反應(yīng)得到1,3-甘油二酯。

30、本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明通過理性設(shè)計，對來源于南極假絲酵母（ candida?antarctica）的脂肪酶a進行定點突變，得到催化活性和對甘油三酯的sn-2位點的選擇性顯著提高的南極假絲酵母脂肪酶a（cala）突變體，并且在制備1,3-甘油二酯時，該cala突變體能顯著提高1,3-甘油二酯的產(chǎn)量。