本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種利用等離子體誘變能源微藻強(qiáng)化藻菌共生體系的方法。

背景技術(shù)：

1、由于污水產(chǎn)量的增加已被證明是人類所設(shè)想的最嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題之一，其中污水中含有有機(jī)成分、懸浮物以及氮、磷等污染成分。若直接排放會(huì)污染當(dāng)?shù)丨h(huán)境加劇污染負(fù)荷，并會(huì)造成富營(yíng)養(yǎng)化，合理經(jīng)濟(jì)有效地處理污水至關(guān)重要。利用污水培養(yǎng)微藻，不僅能凈化污水，而且能獲取制備生物能源的原料，兼具多方面效益，因?yàn)槲鬯械挠袡C(jī)成分、氮、磷可以被微藻吸收和利用，促進(jìn)自身生長(zhǎng)，增加脂質(zhì)含量，從而實(shí)現(xiàn)廢水的凈化和資源化利用，大大提高了微藻在廢水中養(yǎng)殖的可行性。但是在自然條件下，微藻的環(huán)境耐受性較差，很容易受到廢水本身特性的影響，導(dǎo)致生長(zhǎng)效率低。這也是微藻凈化工藝在當(dāng)前廢水處理中不太常用的原因。

2、目前，誘變育種技術(shù)有望改變微藻的耐受性差和在廢水中有效積累生物量的可行性。等離子體（artp）誘變作為一種新興人工誘變技術(shù)，與其它誘變方法相比，電離氣體的產(chǎn)生活性粒子穿透性強(qiáng)，引發(fā)誘變效率更高，是一種應(yīng)用前景廣闊的育種技術(shù)，目前，已有研究證明經(jīng)過(guò)artp誘變的高產(chǎn)脂藻菌株在培養(yǎng)過(guò)程中的生物量積累遠(yuǎn)高于天然藻類菌株，同時(shí)在污水培養(yǎng)中具有更強(qiáng)耐受性和高效產(chǎn)脂的特性。

3、此外，污水中微生物群落復(fù)雜，不僅存在可提高藻類生長(zhǎng)量和油脂含量的細(xì)菌，同時(shí)也存在對(duì)微藻生長(zhǎng)有抑制作用的菌群。所選用鏈帶藻作為一種適宜于污水中生長(zhǎng)的微藻，具有較強(qiáng)的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力。但是自然狀態(tài)下的藻類生物質(zhì)積累效果較差，通常達(dá)不到能源利用的要求。利用人工誘變方式對(duì)微藻的改造，以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)耐受性的高效產(chǎn)油特性，同時(shí)分析突變微藻生物及油脂積累量和在污水中與細(xì)菌的相互作用關(guān)系對(duì)建立穩(wěn)定的藻菌共生體系具有重要的科學(xué)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種利用等離子體誘變能源微藻強(qiáng)化藻菌共生體系的方法，解決了突變微藻生物及油脂積累量和在污水中與細(xì)菌不能共存的缺陷。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明提供的一種利用等離子體誘變能源微藻強(qiáng)化藻菌共生體系的方法，包括以下步驟：

4、步驟1，利用等離子體將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微藻進(jìn)行不同時(shí)間的誘變，得到不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的誘變后的藻液；

5、步驟2，從不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的誘變后的藻液中篩選得到高油脂突變?cè)逯辏?/p>

6、步驟3，將得到的高油脂突變?cè)逯赀M(jìn)行無(wú)菌污水培養(yǎng)，得到具有凈化除污的產(chǎn)油突變微藻；

7、步驟4，確定適合產(chǎn)油突變微藻生長(zhǎng)的最佳稀釋濃度的未滅菌污水；

8、步驟5，確定最佳稀釋濃度的未滅菌污水中利于產(chǎn)油突變微藻生長(zhǎng)的菌種；

9、步驟6，將得到的菌種和產(chǎn)油突變微藻進(jìn)行混合培養(yǎng)，得到藻菌共生體系。

10、優(yōu)選地，步驟1，利用等離子體將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微藻進(jìn)行誘變，得到誘變后的藻液，具體方法是：

11、將藻液放入等離子體反應(yīng)釜中，以設(shè)定的輸入電壓、電流和空氣流量對(duì)藻液進(jìn)行不同時(shí)間的誘變，得到不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的誘變后的藻液。

12、優(yōu)選地，步驟2中，從不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的誘變后的藻液中篩選得到高油脂突變?cè)逯?，具體方法是：

13、將得到的不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的誘變?cè)逡悍謩e在無(wú)菌保護(hù)營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的暗培養(yǎng)后的藻液；

14、將得到的每個(gè)暗培養(yǎng)后的藻液分別涂布于固體平板基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到多個(gè)藻落；

15、從致死率達(dá)到95％以上的藻落中獲取得到初選藻株；

16、將得到的初選藻株進(jìn)行快速培養(yǎng)，并通過(guò)三指標(biāo)篩選原則，獲取得到高油脂產(chǎn)量的突變?cè)逯辍?/p>

17、優(yōu)選地，三指標(biāo)篩選原則具體是：

18、以比生長(zhǎng)速率大于正常株的10%，且以相對(duì)熒光值大于正常株20%為第一篩選原則；

19、以比生長(zhǎng)速率和相對(duì)熒光值的乘積值大于對(duì)照株的35%為第二篩選原則。

20、優(yōu)選地，步驟3中，將得到的高油脂突變?cè)逯赀M(jìn)行無(wú)菌污水培養(yǎng)，得到具有凈化除污的產(chǎn)油突變微藻，具體方法是：

21、將得到的高油脂突變?cè)逯暝跓o(wú)菌污水中進(jìn)行倒置培養(yǎng)，得到顏色和直徑滿足要求的突變微藻；

22、將得到的突變微藻進(jìn)行快速培養(yǎng)，得到具有凈化除污的產(chǎn)油突變微藻。

23、優(yōu)選地，步驟4中，確定適合產(chǎn)油突變微藻生長(zhǎng)的最佳稀釋濃度的未滅菌污水，具體方法是：

24、將得到的產(chǎn)油突變微藻進(jìn)行無(wú)菌污水搖瓶馴化培養(yǎng)，得到馴化后的突變微藻；

25、將得到的馴化后的突變微藻在不同稀釋濃度的未滅菌污水中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)構(gòu)成藻菌初始共生體系；

26、根據(jù)藻菌初始共生體系中馴化后的突變微藻的生物量和油脂積累、污水的污染物去利用效率，確定得到適合馴化后的突變微藻生長(zhǎng)的未滅菌污水的最佳稀釋濃度。

27、優(yōu)選地，步驟5中，確定最佳稀釋濃度的未滅菌污水中利于產(chǎn)油突變微藻生長(zhǎng)的菌種，具體方法是：

28、確定得到未滅菌污水中利于馴化后的突變微藻生長(zhǎng)的菌株；

29、通過(guò)固體平板涂布從得到的菌株中挑選獲得優(yōu)勢(shì)菌株；

30、對(duì)最佳稀釋濃度的未滅菌污水進(jìn)行固體平板涂布，并進(jìn)行恒溫培養(yǎng)進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌落分離，得到優(yōu)勢(shì)菌落；

31、利用固體平板劃線法進(jìn)行優(yōu)勢(shì)菌落純化，得到純化后的菌落；

32、將得到的純化后的菌落，進(jìn)行恒溫?fù)u床活化培養(yǎng)，得到優(yōu)勢(shì)菌種；

33、將得到的優(yōu)勢(shì)菌株和優(yōu)勢(shì)菌種作為利于產(chǎn)油突變微藻生長(zhǎng)的菌種。

34、優(yōu)選地，利用高通量測(cè)序技術(shù)確定得到未滅菌污水中利于馴化后的突變微藻生長(zhǎng)的菌株。

35、優(yōu)選地，步驟1，利用等離子體將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微藻進(jìn)行誘變，得到誘變后的藻液，具體方法是：

36、將藻液放入等離子體反應(yīng)釜中，以設(shè)定的輸入電壓、電流和空氣流量對(duì)藻液進(jìn)行不同時(shí)間的誘變，得到不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的誘變后的藻液；

37、步驟2中，從不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的誘變后的藻液中篩選得到高油脂突變?cè)逯?，具體方法是：

38、將得到的不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的誘變?cè)逡悍謩e在無(wú)菌保護(hù)營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行暗培養(yǎng)，得到不同時(shí)間對(duì)應(yīng)的暗培養(yǎng)后的藻液；

39、將得到的每個(gè)暗培養(yǎng)后的藻液分別涂布于固體平板基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到多個(gè)藻落；

40、從致死率達(dá)到95％以上的藻落中獲取得到初選藻株；

41、將得到的初選藻株進(jìn)行快速培養(yǎng)，并通過(guò)三指標(biāo)篩選原則，獲取得到高油脂產(chǎn)量的突變?cè)逯辍?/p>

42、一種藻菌共生體系，基于所述的方法強(qiáng)化得到。

43、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

44、本發(fā)明提供的一種高效等離子體誘變能源微藻與細(xì)菌共生體系的構(gòu)建方法，該方法中微藻先經(jīng)artp誘變初步篩選出高產(chǎn)油量的藻株，再經(jīng)過(guò)滅菌污水篩選和馴化，得到較高生物量和油脂積累以及高污染物的去除的突變能源藻株，構(gòu)建突變能源微藻與污水中優(yōu)勢(shì)菌的菌藻共生系統(tǒng)。

45、為了更好的反映誘變后的能源微藻對(duì)污水中污染物的利用能力和與污水中細(xì)菌構(gòu)成穩(wěn)定的藻菌共生體系凈化水體的潛力，同時(shí)考慮到誘變微藻的生物量和油脂含量的積累。本發(fā)明通過(guò)對(duì)微藻進(jìn)行artp誘變，經(jīng)初步篩選獲得高產(chǎn)油量的藻株，然后在為滅菌污水營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的固體平板中再次篩選出適合在污水中生長(zhǎng)的突變能源微藻。再通過(guò)滅菌污水馴化，得到較高生物量和油脂積累以及高污染物的去除的突變?cè)逯?，把馴化后突變能源微藻在稀釋倍數(shù)為2、4、6、8、10、20倍污水中培養(yǎng)構(gòu)建菌藻共生系統(tǒng)。通過(guò)觀察藻菌共生體系中突變能源微藻的生物量和油脂積累、污水的污染物去利用效率，確定最適合突變能源微藻生長(zhǎng)的污水濃度。對(duì)最佳濃度的有菌污水中菌群功能結(jié)構(gòu)的變化分析，獲得優(yōu)勢(shì)菌株。然后對(duì)污水培養(yǎng)液進(jìn)行固體平板涂布分離污水中優(yōu)勢(shì)菌，把分離后的優(yōu)勢(shì)菌種以不同的接種濃度及不同種類組合與突變能源微藻在滅菌污水混合培養(yǎng)，進(jìn)一步評(píng)估共生體系運(yùn)行穩(wěn)定性，不斷優(yōu)化培養(yǎng)條件包括溫度、ph、和藻菌接種比，通過(guò)突變微藻的生長(zhǎng)、油脂積累和污染物利用效率以及微生物群落的變化，從而建立穩(wěn)定高效的菌藻共生系統(tǒng)。來(lái)證明經(jīng)過(guò)artp誘變后的微藻在污水中培養(yǎng)相比原始微藻的優(yōu)勢(shì)。能否提高微藻油脂產(chǎn)量、降低培養(yǎng)成本，關(guān)鍵篩選出突變能源微藻在污水培養(yǎng)既具有快速繁殖又能保持較高的油脂含量，同時(shí)與污水中的細(xì)菌形成穩(wěn)定的藻菌共生系統(tǒng)。因此突變能源微藻與污水中細(xì)菌構(gòu)建穩(wěn)定的藻菌共生系統(tǒng)的方法在生物質(zhì)能源領(lǐng)域和污水凈化領(lǐng)域扮演著越來(lái)越重要。本發(fā)明構(gòu)建的高效藻菌共生體系可用于以下幾個(gè)方面：

46、(1)可培養(yǎng)出在污水中具有強(qiáng)耐受性和高效產(chǎn)油特性的突變微藻，對(duì)建立穩(wěn)定的藻菌共生體系具有重要的科學(xué)意義；

47、(2)可提高突變能源微藻在污水中的油脂積累和污染物的利用效率，在生物質(zhì)能源領(lǐng)域和污水回收再利用有較大潛力；

48、(3)可得到突變能源微藻與污水培養(yǎng)微藻中的優(yōu)勢(shì)菌種的微生物群落結(jié)構(gòu)的遷移變化的規(guī)律，分析藻菌互作規(guī)律，對(duì)深入解析藻菌共生機(jī)理的理論意義巨大。

49、綜上所述，本發(fā)明先通過(guò)artp誘變，獲得了高產(chǎn)油突變能源藻株，通過(guò)滅菌污水篩選出適合在污水中生長(zhǎng)的高產(chǎn)油突變能源微藻，將高產(chǎn)油量的突變能源藻株在滅菌污水中馴化，得到較高生物量和油脂積累以及污染物利用效率高的突變能源藻株，馴化后突變能源微藻在稀釋不同倍數(shù)污水中培養(yǎng)構(gòu)建菌藻共生系統(tǒng)。觀察藻菌共生體系中突變能源微藻的生物量和油脂積累、污水的污染物去利用效率以及微生物群落的變化。然后對(duì)污水培養(yǎng)液進(jìn)行固體平板涂布分離污水中優(yōu)勢(shì)菌，把分離后的優(yōu)勢(shì)菌種以不同組合與突變能源微藻在滅菌污水混合培養(yǎng)，進(jìn)一步評(píng)估共生體系運(yùn)行穩(wěn)定性，從而建立穩(wěn)定高效的菌藻共生系統(tǒng)。