本發(fā)明涉及生物檢測，具體涉及一種基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針及其應用。

背景技術：

1、公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經(jīng)成為本領域一般技術人員所公知的現(xiàn)有技術。

2、由于世界范圍的抗生素的大規(guī)模使用和濫用，各種“多重耐藥細菌”不斷出現(xiàn)，對人類的健康提出了嚴峻的挑戰(zhàn)，已經(jīng)成為全球公共健康最大的威脅之一。通過隨機突變或表達潛在抗性基因等方式使細菌獲得抗生素抗性是抗生素抗性基因(args)的重要來源之一。因此，對于細菌核苷酸突變的情況的分析至關重要。

3、傳統(tǒng)的細菌分析需經(jīng)培養(yǎng)、增菌和分離，這一過程耗時長，操作繁瑣，對基因?qū)哟蔚姆治鋈孕杞Y合新技術。目前，細菌基因?qū)哟蔚难芯看蠖嘁蕾嚮驕y序技術，實現(xiàn)在分子和基因?qū)用鎸ι矬w的進階分析和解讀，主要包括16s?rrna、its?rrna。然而，以16s為代表的高通量測序技術盡管能夠直接實現(xiàn)對樣本中獲得的基因片段進行序列分析，實現(xiàn)對樣本的微生物群落結構和多樣性的研究，但也面臨諸多難題，首先，其投入成本高、數(shù)據(jù)量龐大、分析要求高、耗時長，同時對于檢測的儀器設備要求較高；第二，在測序分析中，單堿基突變的識別檢測難度大，仍舊存在漏檢、錯檢的可能性。此外，現(xiàn)有的基于非測序手段的突變檢測技術，例如等溫擴增技術(lamp)、聚合酶鏈式反應技術(pcr)，多聚焦于單一突變位點的識別，痕量檢測的生物傳感過程涉及在溶液中不斷尋找目標dna，反應時間延長，檢測效率低，并且開發(fā)的方法使用場景受限，未能較好實現(xiàn)對不同類型樣本的多突變位點的動態(tài)跟蹤和評估。

技術實現(xiàn)思路

1、為了克服上述問題，本發(fā)明提供了一種基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針及其應用。

2、為實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

3、本發(fā)明的第一個方面，提供了一種基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針，包括：

4、多個單核苷酸突變識別單元，以及偶聯(lián)多個單核苷酸突變識別單元的dna納米線。

5、在一種或多種實施方式中，所述單核苷酸突變識別單元均是由dna四面體和一個x型結構構成；

6、所述dna四面體由dna單鏈s1～s4組成，其中任一dna單鏈與另外三條通過堿基互補配對相連接；

7、dna單鏈s1的5’端分別與dna單鏈right-up、dna單鏈right-down、dna單鏈left-down兩兩堿基互補配對形成x型結構；

8、dna單鏈s1的5’端設置包括核苷酸a、t、g或c的粘性末端。

9、所述dna四面體由dna單鏈s1～s4組成，其中任一dna單鏈與另外三條通過堿基互補配對相連接，dna單鏈s1的5’端分別與dna單鏈right-up、dna單鏈right-down、dna單鏈left-down兩兩堿基互補配對形成x型結構。這種的結構不僅可以檢測目標物，并且探針可使用時間較長，不會瞬間被細胞內(nèi)的核酸酶降解，進而出現(xiàn)假陽性。

10、優(yōu)選的，dna單鏈s1的3’末端修飾熒光淬滅基團；left-down的5’末端修飾熒光基團；

11、進一步優(yōu)選地，本發(fā)明中相鄰的單核苷酸突變識別單元中熒光淬滅基團與熒光基團均不同。

12、x型結構與dna四面體結構作為一個整體，dna單鏈s1的3’末端修飾熒光淬滅基團以及l(fā)eft-down的5’末端修飾熒光基團相互靠近，因為能量共振轉(zhuǎn)移，使得單核苷酸突變識別單元不發(fā)光。當出現(xiàn)目標物時，目標物與x型結構中的dna單鏈s1率先結合，發(fā)生toehold介導的鏈取代反應，進而替換了發(fā)揮封閉作用的left-down和right-down，識別完成后使x型探針的穩(wěn)定構象發(fā)生改變，將熒光基團與猝滅基團分開，進一步釋放熒光基團，從而發(fā)光。本發(fā)明中每個單核苷酸突變識別單元中熒光基團不同，在不同的激發(fā)波長下，可以檢測限定位置的單核苷酸突變，進而最終可以檢測出多個位點單核苷酸突變。

13、優(yōu)選的，dna單鏈s1～s4以及dna單鏈right-up、dna單鏈right-down、dna單鏈left-down的核酸序列如seq?id?no.1～17所示。

14、在一種或多種實施方式中，所述dna納米線與dna單鏈s3的5’端通過堿基互補配對相連接。

15、優(yōu)選的，所述dna納米線的核酸序列如seq?id?no.18所示。

16、將多個單核苷酸突變識別單元通過dna納米線串聯(lián)，構建dna納米結構網(wǎng)絡，當出現(xiàn)多位點單核苷酸突變的目標物時，目標物會同時與多個單核苷酸突變識別單元結合，進而實現(xiàn)不同位點熒光強度的增強。本發(fā)明中每個單核苷酸突變識別單元中熒光基團不同，在不同的激發(fā)波長下，可以檢測限定位置的單核苷酸突變，進而最終可以檢測出多個位點單核苷酸突變。再者，在識別多位點單核苷酸突變的目標物時，當某個單核苷酸突變識別單元與目標物上的一個突變靶點結合后，該目標物就會被限域，此時，dna納米結構網(wǎng)絡中的其余的單核苷酸突變識別單元能能夠快速地完成其他相應突變靶點的識別，大大提高了多位點單堿基突變的檢測效率，實現(xiàn)在復雜背景樣本中低豐度的突變核酸檢測。

17、本發(fā)明的第二個方面，提供上述基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針的制備，包括：

18、將單核苷酸突變識別單元與dna納米線孵育后獲得基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針。

19、識別單元與dna納米線的比例依賴于dna納米線的連接識別單元的數(shù)量。

20、在一種或多種實施方式中，用含氯化鎂的0.01m～0.03m?hepes溶液稀釋單核苷酸突變識別單元至80～120nmol/l；

21、優(yōu)選的，用0.02m?hepes溶液稀釋單核苷酸突變識別單元至100nmol/l；

22、更優(yōu)選地，所述hepes溶液中含有12.5mm氯化鎂。

23、在一種或多種實施方式中，孵育的時間為1.5～3h，優(yōu)選為2h。

24、本發(fā)明的第三個方面，提供上述基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針在檢測細菌多位點單核苷酸突變體中應用。

25、在一種或多種實施方式中，多位點單核苷酸突變體的核酸序列如seq?id?no.19所示。

26、本發(fā)明的第四個方面，提供一種檢測細菌多位點單核苷酸突變體的方法，包括：

27、(1)獲取基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針中不同單核苷酸突變識別單元的初始熒光信號f0；

28、(2)在基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針的溶液中加入待測dna，加入緩沖液使探針最終濃度為80～120nm，共孵育后，再次獲取不同單核苷酸突變識別單元的熒光信號f；

29、(3)通過初始熒光信號f0與共孵育后熒光信號f差值來判斷待測dna是否發(fā)生多位點單核苷酸突變。

30、在一種或多種實施方式中，多位點單核苷酸突變體的核酸序列如seq?id?no.19所示。

31、在一種或多種實施方式中，所述孵育條件為：37℃孵育35～45min；所述緩沖液為hepes緩沖液。

32、在一種或多種實施方式中，步驟(3)中，如果某個單核苷酸突變識別單元中的初始熒光信號f0與共孵育后熒光信號f存在差值，表示該單核苷酸突變識別單元中發(fā)生了單核苷酸突變。

33、本發(fā)明的第五個方面，提供一種檢測細菌多位點單核苷酸突變體的產(chǎn)品，包括第一方面所述的上述基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針。

34、在一種或多種實施方式中，所述產(chǎn)品包括生物傳感器、試紙條或試劑盒。

35、優(yōu)選的，所述試劑盒還包括hepes緩沖液。此外，還可包括其他一切維持探針活性的緩沖液。

36、本發(fā)明的有益效果在于：

37、(1)本發(fā)明提供了一種基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針，包括：多個單核苷酸突變識別單元，以及偶聯(lián)多個單核苷酸突變識別單元的dna納米線。將多個單核苷酸突變識別單元通過dna納米線串聯(lián)，構建dna納米結構網(wǎng)絡，當出現(xiàn)多位點單核苷酸突變的目標物時，目標物會同時與多個單核苷酸突變識別單元結合，進而增強熒光強度。本發(fā)明中每個單核苷酸突變識別單元中熒光基團不同，在不同的激發(fā)波長下，可以檢測限定位置的單核苷酸突變，進而最終可以檢測出多個位點單核苷酸突變。同時，在識別多位點單核苷酸突變的目標物時，當某個單核苷酸突變識別單元與目標物上的一個突變靶點結合后，該目標物就會被限域，此時，dna納米結構網(wǎng)絡中的其余的單核苷酸突變識別單元能能夠快速地完成其他相應突變靶點的識別，大大提高了多位點單堿基突變的檢測效率，實現(xiàn)在復雜背景樣本中低豐度的突變核酸檢測。

38、(2)本發(fā)明提供的基于限域效應的檢測多位點單核苷酸突變的探針，表現(xiàn)出較強的特異性和選擇性，能夠在多種干擾物質(zhì)存在的情況下，準確檢測目標物，滿足臨床需求。