本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的工藝。

背景技術(shù)：

1、聚谷氨酸(poly-γ-glutamic?acid,γ-pga)是在一些特定的微生物中發(fā)現(xiàn)的天然聚氨基酸,是一種由谷氨酸通過γ-酰胺鍵連接聚合而成的多功能肽,目前可以通過微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)規(guī)模制備。γ-pga的羧基可與羥基結(jié)合，安全無毒，具有優(yōu)良的水溶性、保濕型、吸附性、緩釋性、抗凍性等多種生物學(xué)特性，可作為保濕劑、絮凝劑、凍干保護(hù)劑、藥物載體、緩釋劑以及醫(yī)藥敷料等應(yīng)用于多種領(lǐng)域，產(chǎn)生巨大的社會(huì)效益和商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。γ-pga具有極強(qiáng)的水溶性、可生物降解性、生物相容性、安全無毒、可食用和環(huán)境友好的生物學(xué)特性，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)藥、食品、工業(yè)和化妝品等領(lǐng)域，是一種較為理想的新型生物材料，擁有巨大的應(yīng)用前景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，近年來引起越來越多的國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。

2、產(chǎn)生γ-pga的菌株根據(jù)生物聚合物生產(chǎn)對(duì)l-谷氨酸的需求分為兩類：l-谷氨酸依賴性和非依賴性菌株。依賴于l-谷氨酸的菌株，在其培養(yǎng)基中添加前體物l-谷氨酸能夠高水平地生物合成γ-pga。由于非依賴性菌株發(fā)酵γ-pga產(chǎn)量不高，當(dāng)前市場上主要利用l-谷氨酸依賴性菌株進(jìn)行γ-pga生產(chǎn)。在獲得高產(chǎn)菌株的前提下，通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基（如碳源、氮源、無機(jī)鹽等）、優(yōu)化發(fā)酵條件（如溫度、p?h值、溶氧等）、選擇合適的發(fā)酵方式（如分批發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、分批補(bǔ)料發(fā)酵等）是提高γ-pga產(chǎn)量的重要手段。

3、中國專利“cn110669798a，農(nóng)用低成本聚谷氨酸的生產(chǎn)方法”，針對(duì)特定枯草芽孢桿菌cgmcc?no.2108，通過發(fā)酵培養(yǎng)基中添加殼聚糖和氯化鈉，來改變細(xì)胞壁的通透性，促進(jìn)聚谷氨酸分泌到胞外，提高了聚谷氨酸的產(chǎn)量。

4、中國專利“cn116144532a,一種高效制備農(nóng)業(yè)用γ-聚谷氨酸的方法”,采用紫外誘變技術(shù)進(jìn)行誘變，經(jīng)過24代誘變得到變異菌株枯草芽孢桿菌pga2020-10,較出發(fā)菌株的發(fā)酵產(chǎn)量提高了16%,并且能夠高效利用甘油發(fā)酵產(chǎn)聚谷氨酸。

5、文獻(xiàn)“添加物對(duì)枯草芽胞桿菌γ-聚谷氨酸合成代謝的影響，生物加工工程2010年”對(duì)枯草芽孢桿菌hcul-b115代謝網(wǎng)絡(luò)和發(fā)酵特性研究的基礎(chǔ)上,通過添加適量的氨基酸、有機(jī)酸和維生素對(duì)聚γ谷氨酸發(fā)酵進(jìn)行合成代謝進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，l-谷氨酸、l-苯丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬氨酸、l-纈氨酸、延胡索酸、草酸、丙二酸、煙酸和抗壞血酸等添加物對(duì)菌株hcul-b115合成聚γ谷氨酸有明顯促進(jìn)作用。該菌株屬于非l-谷氨酸依賴性菌株，自身能夠大量合成谷氨酸。通過加入l-纈氨酸和l-苯丙氨酸使代謝流向丙酮酸方向，從而胞內(nèi)有較多的丙酮酸進(jìn)入tca循環(huán)，增加了l谷氨酸的積累，從而使得聚谷氨酸合成增加。

6、聚谷氨酸的發(fā)酵研究還相對(duì)較少，如何提高聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)酸量是需要不斷探索的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在cn116144532a的基礎(chǔ)上，繼續(xù)研究和優(yōu)化pga2020-10的發(fā)酵能力，從而增加聚谷氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量。

2、本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。

3、一種發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的工藝，其包括如下步驟：

4、將枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液按1-5%的接種量轉(zhuǎn)入到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過流加葡萄糖溶液控制還原糖濃度不低于0.5%，流加氨水調(diào)節(jié)ph值至7.0，培養(yǎng)時(shí)間36h，得到聚谷氨酸發(fā)酵液；

5、所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖40g/l、玉米漿20g/l、酵母膏10g/l、谷氨酸鈉50g/l、硫酸銨6g/l、甘油5g/l、d-苯丙氨酸4g/l、磷酸二氫鉀0.2g/l、磷酸氫二鉀0.2g/l、七水硫酸鎂0.1g/l、七水硫酸亞鐵1mg/l，溶劑為水。

6、優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖40g/l、玉米漿20g/l、酵母膏10g/l、谷氨酸鈉?50g/l、氯化鈉40g/l、硫酸銨6g/l、甘油5g/l、d-苯丙氨酸4g/l、磷酸二氫鉀0.2g/l、磷酸氫二鉀0.2g/l、七水硫酸鎂0.1g/l、七水硫酸亞鐵1mg/l，溶劑為水。

7、優(yōu)選地，所述培養(yǎng)條件為：ph值7.0，溫度37℃，壓力0.05mpa，溶氧控制在10%。

8、進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液的制備方法包括：

9、1）將枯草芽孢桿菌pga2020-10（cgmcc?no.23581）進(jìn)行活化，接種于斜面種子培養(yǎng)基，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)48h；

10、2）無菌條件下，將斜面菌種接種到一級(jí)種子培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，得到一級(jí)種子液；

11、3）將一級(jí)種子液按照12%的接種量接入到二級(jí)種子培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至od600值為4，得到二級(jí)種子液。

12、具體地，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌pga2020-10。

13、優(yōu)選地，所述斜面種子培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10g/l、酵母膏2g/l、葡萄糖5g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂20g/l、磷酸二氫鉀1g/l，ph控制在7.0。

14、優(yōu)選地，所述一級(jí)種子培養(yǎng)基和二級(jí)種子培養(yǎng)基組分均為：葡萄糖30g/l、玉米漿10g/l、酵母膏10g/l、磷酸二氫鉀0.5g/l、磷酸氫二鉀0.5g/l；ph控制在7.0。

15、本發(fā)明取得的有益效果主要包括以下幾個(gè)方面：

16、聚谷氨酸的合成和分泌受細(xì)胞通透性和外排等多方面因素的影響，本發(fā)明通過研究d-苯丙氨酸、氯化鈉、三氯化鐵三種組分對(duì)pga2020-10發(fā)酵能力的影響，發(fā)現(xiàn)d-苯丙氨酸、三氯化鐵能夠提高pga2020-10合成聚谷氨酸的能力，氯化鈉影響較小。d-苯丙氨酸聯(lián)合氯化鈉使用明顯優(yōu)于單獨(dú)使用d-苯丙氨酸，二者具備一定的協(xié)同作用，d-苯丙氨酸和三氯化鐵聯(lián)合使用并不能達(dá)到相互促進(jìn)的技術(shù)效果。

技術(shù)特征：

1.一種發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的工藝，其包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖40g/l、玉米漿20g/l、酵母膏10g/l、谷氨酸鈉?50g/l、氯化鈉40g/l、硫酸銨6g/l、甘油5g/l、d-苯丙氨酸4g/l、磷酸二氫鉀0.2g/l、磷酸氫二鉀0.2g/l、七水硫酸鎂0.1g/l、七水硫酸亞鐵1mg/l，溶劑為水。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，所述培養(yǎng)條件為：溫度37℃，壓力0.05mpa，溶氧控制在10%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液的制備方法包括：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工藝，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌pga2020-10，保藏號(hào)為cgmcc?no.23581。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的工藝，其特征在于，所述斜面種子培養(yǎng)基組分為：蛋白胨10g/l、酵母膏2g/l、葡萄糖5g/l、氯化鈉5g/l、瓊脂20g/l、磷酸二氫鉀1g/l，ph控制在7.0。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的工藝，其特征在于，所述一級(jí)種子培養(yǎng)基和二級(jí)種子培養(yǎng)基組分均為：葡萄糖30g/l、玉米漿10g/l、酵母膏10g/l、磷酸二氫鉀0.5g/l、磷酸氫二鉀0.5g/l；ph控制在7.0。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種發(fā)酵生產(chǎn)聚谷氨酸的工藝，其包括如下步驟：將枯草芽孢桿菌二級(jí)種子液按1?5%的接種量轉(zhuǎn)入到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h，得到聚谷氨酸發(fā)酵液；發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖40g/L、玉米漿20g/L、酵母膏10g/L、谷氨酸鈉50g/L、硫酸銨6g/L、甘油5g/L、D?苯丙氨酸4g/L、磷酸二氫鉀0.2g/L、磷酸氫二鉀0.2g/L、七水硫酸鎂0.1g/L、七水硫酸亞鐵1mg/L。本發(fā)明通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組分，提高了聚谷氨酸合成效率。本發(fā)明還采用谷氨酸提取廢水替換發(fā)酵培養(yǎng)基用水，利用了廢水中殘余的谷氨酸，提高了谷氨酸提取廢水的綜合效益。

技術(shù)研發(fā)人員：董力青,邊恩來,時(shí)夫龍,呂寶龍,張啟隆,伏廣好,王建文,王志遠(yuǎn),祝咸達(dá),鄭嘉嘉
受保護(hù)的技術(shù)使用者：內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/4