本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)，涉及口腔生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，具體來說，涉及牙根類器官、其構(gòu)建方法、應(yīng)用及誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

1、牙根是牙體組織的重要組成部分，通過牙周膜連接于牙槽窩內(nèi)，具有固位、支撐、傳遞和感知咬合應(yīng)力等功能。因根管治療后牙髓功能缺失導(dǎo)致的牙根脆性增加乃至牙根折裂、因正畸牙移動可能導(dǎo)致的牙根吸收、因各種創(chuàng)傷引起的牙根折斷以及各種先天后天因素引起的牙根發(fā)育不良等等，均可導(dǎo)致牙根功能缺失、甚至牙齒脫落進(jìn)而影響咀嚼、發(fā)音功能已經(jīng)面容改變等等。目前臨床對于牙根損傷的治療一般以局部粘接、纖維樁加固等為主，對應(yīng)嚴(yán)重根折或斷裂的牙根則只能外科拔除后以種植體進(jìn)行修復(fù)，均為贗復(fù)體修復(fù)，尚無法實(shí)現(xiàn)生理性牙根功能再生?；谄鞴侔l(fā)育原理的組織再生是近年來組織工程再生的熱點(diǎn)，即通過解析器官發(fā)育過程中的細(xì)胞和分子信號并應(yīng)用于組織再生。牙根的發(fā)育是在牙冠發(fā)育完成后，牙胚頸環(huán)處的內(nèi)釉上皮細(xì)胞和外釉上皮細(xì)胞向未來根尖孔方向生長，形成赫特維希上皮根鞘(hertwig's?epithelial?root?sheath，hers)。hers包繞牙乳頭細(xì)胞，通過上皮-間充質(zhì)相互作用，誘導(dǎo)牙乳頭細(xì)胞分化成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體，形成牙根部的牙本質(zhì)和牙髓腔及牙髓組織。這一過程中，hers作為牙根生發(fā)中心，在牙根發(fā)育過程中起到至關(guān)重要的作用，hers通過hh信號通路、bmp信號通路等誘導(dǎo)牙乳頭細(xì)胞分化，調(diào)控牙根的形成。

2、類器官(organoids)是近年來迅速發(fā)展的新興生物技術(shù),主要通過各種來源的干細(xì)胞自組裝,在體外人工三維培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化形成有結(jié)構(gòu)和功能特征的組織復(fù)合體。類器官具有來源組織或器官的全部或部分關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和功能特征。目前，研究者已成功建立多種組織類器官模型如腦、肝、腎、腸等。類器官技術(shù)在器官發(fā)育、疾病模擬、藥物篩選和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域顯示出廣泛應(yīng)用前景。如前所述，牙根在發(fā)育過程中主要以hers和牙間充質(zhì)細(xì)胞相互誘導(dǎo)形成。hers細(xì)胞是牙齒發(fā)育過程中階段性存在的上皮細(xì)胞，在牙根發(fā)育完成后僅以少量的malassez上皮剩余的形式殘留于牙周膜中，不易獲取和純化。目前尚未有模擬牙根發(fā)育原理(即利用hers細(xì)胞和牙間充質(zhì)相互誘導(dǎo)的作用原理)構(gòu)建牙根類器官(tooth?root?organoid)的研究。通過文獻(xiàn)檢索，關(guān)于牙根類器官的研究，僅有2024年在tissue?engineering?part?a發(fā)表的一篇文章研究關(guān)于牙根類器官的構(gòu)建(calabrese?tc,et?al.tissue?eng?part?a.2024may；30(9-10):404-414.doi:10.1089/ten.tea.2023.0219.)該研究是以牙周膜干細(xì)胞(periodontal?ligament(pdl)stem/progenitor?cells,pdlscs)和牙髓干細(xì)胞(dental?pulp?stem/progenitor?cells,dpscs)自組裝形成，尚不能完全模擬牙根發(fā)育過程中hers細(xì)胞介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)相互作用。

3、因此，提供一種牙根類器官的構(gòu)建方法，能模擬牙根發(fā)育過程中hers細(xì)胞介導(dǎo)的上皮-間充質(zhì)相互作用，為牙根發(fā)育機(jī)制探索、生理性牙根再生等提供體外模型或生物活性移植材料，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于，提供一種牙根類器官的構(gòu)建方法，采用該方法可在3-4周內(nèi)在形成牙根類器官，對牙根發(fā)育機(jī)制、牙根發(fā)育不良的發(fā)病機(jī)制、生物牙根再生等研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

2、本發(fā)明的目的之二在于，提供該構(gòu)建方法構(gòu)建的牙根類器官。

3、本發(fā)明的目的之三在于，提供該牙根類器官的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的之四在于，提供一種用于誘導(dǎo)分化該牙根類器官的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

5、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

6、本發(fā)明公開的一種牙根類器官的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

7、步驟1.細(xì)胞復(fù)蘇：將液氮保存的工程化牙上皮細(xì)胞復(fù)蘇，重懸，制得牙上皮細(xì)胞懸液，備用；

8、步驟2.培養(yǎng)牙囊干細(xì)胞微球：取牙囊干細(xì)胞，重懸后種至細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板離心，使牙囊干細(xì)胞聚集于培養(yǎng)孔底形成牙囊干細(xì)胞團(tuán)，添加培養(yǎng)基，培養(yǎng)，形成牙囊干細(xì)胞微球；

9、步驟3.取步驟2培養(yǎng)形成牙囊干細(xì)胞微球后的培養(yǎng)板，離心，吸去上清，加入牙上皮細(xì)胞懸液，靜置后，再添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，使牙上皮細(xì)胞復(fù)合在牙囊干細(xì)胞微球表面，形成牙根類器官。

10、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，牙根類器官的構(gòu)建方法還包括三維培養(yǎng)步驟，具體為：

11、步驟4.收集步驟3培養(yǎng)形成的牙上皮/間充質(zhì)干細(xì)胞球，清洗后，轉(zhuǎn)移至三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)中繼續(xù)培養(yǎng)，形成三維培養(yǎng)后的牙根類器官；

12、優(yōu)選地，三維旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)速為12r-14r/min，置于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-7天后，形成三維培養(yǎng)后的牙根類器官。

13、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，所述工程化牙上皮細(xì)胞包括工程化牙上皮細(xì)胞系hers-h1；

14、所述步驟1中牙上皮細(xì)胞懸液中細(xì)胞濃度為103～104個/100μl。

15、本發(fā)明所述的工程化牙上皮細(xì)胞系hers-h1保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，名稱為：sd大鼠牙胚赫特希上皮根鞘細(xì)胞系hers-h1(hertwig`s?epithelial?root?sheath,hers-h1)保藏號為cctcc?no：c2017249，保藏時(shí)間為2017年11月21日，保藏地址為湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號。

16、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，所述步驟2中的牙囊干細(xì)胞為第3或第4代牙囊干細(xì)胞；

17、優(yōu)選地，取牙囊干細(xì)胞，加培養(yǎng)基重懸后，調(diào)整細(xì)胞濃度為103～104個/100μl，接種于培養(yǎng)板中；

18、優(yōu)選地，培養(yǎng)板以800-1500rpm離心2～10min使細(xì)胞聚集于培養(yǎng)孔底形成牙囊干細(xì)胞團(tuán)；

19、優(yōu)選地，離心后的培養(yǎng)板置于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，持續(xù)培養(yǎng)3-5天后形成牙囊干細(xì)胞微球。

20、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，所述步驟3中，取步驟2培養(yǎng)形成牙囊干細(xì)胞微球后的培養(yǎng)板，培養(yǎng)板以800-1500rpm離心2～10min，吸去上清，加入牙上皮細(xì)胞懸液；優(yōu)選地，加入牙上皮細(xì)胞懸液后，培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移至37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中靜置1-2小時(shí)，再添加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；

21、進(jìn)一步優(yōu)選地，將添加了培養(yǎng)基的培養(yǎng)板置于37℃、5％co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5天，使牙上皮細(xì)胞復(fù)合在牙囊干細(xì)胞微球表面，形成牙上皮/間充質(zhì)干細(xì)胞球。

22、本發(fā)明公開的采用上述構(gòu)建方法得到的牙根類器官。

23、本發(fā)明公開的上述牙根類器官的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括在制備體外模型或生物活性移植材料中的應(yīng)用。

24、本發(fā)明公開的一種用于誘導(dǎo)分化上述牙根類器官的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的組分；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為epithelial?cell?medium培養(yǎng)基，向該基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的組分及含量如下：

25、50～200μg/l的bfgf、200～400μg/l的pdgf、100～300μg/l的bmp4、50～200μg/l的wnt10a、0.5-2mg/l的重組人胰島素、50～200mg/l的維生素c、50～200nm的γ-secretase抑制劑ly411575、5～20nm的dna甲基化酶抑制劑5-aza-dc、5～20nm的地塞米松、0.5～2mm的β-甘油磷酸鈉。

26、本發(fā)明的部分實(shí)施方案中，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入的組分及含量如下：

27、100μg/l的bfgf、300μg/l的pdgf、200μg/l的bmp4、100μg/l的wnt10a、1mg/l的重組人胰島素、100mg/l的維生素c、100nm的γ-secretase抑制劑、10nm的dna甲基化酶抑制劑、10nm的地塞米松、1mm的β-甘油磷酸鈉。

28、優(yōu)選地，γ-secretase抑制劑為ly411575；

29、優(yōu)選地，dna甲基化酶抑制劑為5-aza-dc。

30、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

31、本發(fā)明利用發(fā)明人前期構(gòu)建的工程化牙上皮細(xì)胞赫特維希上皮細(xì)胞系(hers-h1)作為hers細(xì)胞的來源，通過牙囊干細(xì)胞作為牙間充質(zhì)細(xì)胞來源，構(gòu)建牙根類器官，為牙根發(fā)育機(jī)制探索、生理性牙根再生等提供體外模型或生物活性移植材料。

32、本發(fā)明構(gòu)建的牙根類器官在組織形態(tài)和細(xì)胞成分上，與正常發(fā)育中的牙根組織具有相似的組織形態(tài)和細(xì)胞成分。

33、本發(fā)明中英文簡寫對應(yīng)的中文名稱為：

34、bfgf：堿性成纖維細(xì)胞生長因子

35、pdgf：血小板源性生長因子

36、bmp4：人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4

37、wnt10a：無翅型mmtv整合位點(diǎn)蛋白家族成員10a

38、5-aza-dc：地西他濱，也被稱為5-aza-2'-脫氧胞苷。