本發(fā)明屬于生物技術(shù)，具體涉及一種根據(jù)trna表達(dá)特征提升蛋白質(zhì)生物合成效率的方法。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)是承擔(dān)生命活動(dòng)的主要功能分子，其合成過(guò)程被稱為翻譯。該過(guò)程以mrna作為模板并在核糖體的參與下，通過(guò)trna將mrna上的核苷酸序列轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)應(yīng)的氨基酸序列，從而合成多肽鏈。蛋白質(zhì)翻譯是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育和維持生命活動(dòng)的基礎(chǔ)，其翻譯效率是細(xì)胞調(diào)控基因表達(dá)的重要手段之一，受多種因素調(diào)節(jié)。在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中，密碼子的使用通過(guò)翻譯依賴和翻譯不依賴的機(jī)制在調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著多重作用。同義密碼子被同源trna識(shí)別的效率不同，在不同的真核生物和原核生物中，密碼子使用偏差與同源trna水平或trna基因拷貝數(shù)相關(guān)(doi:10.1186/s12964-020-00642-6)。因此，密碼子的選擇會(huì)影響翻譯效率。

2、現(xiàn)已確定在mrna翻譯延伸過(guò)程中，密碼子在調(diào)節(jié)翻譯速率方面扮演著重要的角色(doi:10.1146/annurev-biochem-052621-091808)。通常，采用宿主偏好的密碼子能夠有效提升核糖體的翻譯速率與效率，進(jìn)而減少翻譯過(guò)程中的停滯現(xiàn)象；相對(duì)而言，稀有密碼子的使用則可能導(dǎo)致核糖體在mrna上的停滯，從而可能會(huì)造成翻譯的提前終止(doi:10.1126/science.aad9868)。密碼子最優(yōu)性在翻譯效率水平上影響基因表達(dá)，富集最優(yōu)密碼子和非最優(yōu)密碼子的報(bào)告子在蛋白質(zhì)水平上的差異往往大于rna水平上的差異(doi:10.1038/s41598-020-74091-z)。故通過(guò)密碼子優(yōu)化可以增加多種真核生物和原核生物內(nèi)源和外源蛋白的翻譯效率，顯著提高mrna的穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)的高效大量表達(dá)。

3、密碼子優(yōu)化的基本原則就是用宿主細(xì)胞中使用頻率高的同義密碼子去替換稀有密碼子，以適應(yīng)宿主細(xì)胞的偏好，從而優(yōu)化翻譯過(guò)程。事實(shí)上，大量研究表明trna的相對(duì)豐度和可用性是翻譯效率的限速步驟，對(duì)密碼子介導(dǎo)的穩(wěn)定性動(dòng)力學(xué)有影響。trna的表達(dá)具有組織特異，任何給定密碼子的調(diào)控特性都可能根據(jù)trna可用性的條件和組織特異性差異而變化(72-74)。因此，trna的相對(duì)豐度對(duì)密碼子優(yōu)化是一個(gè)不可忽視的因素。而傳統(tǒng)密碼子優(yōu)化方法是以密碼子適應(yīng)性指數(shù)(codon?adaptation?index，cai)為重要指標(biāo)，同時(shí)考慮mrna二級(jí)結(jié)構(gòu)和gc含量等因素進(jìn)行優(yōu)化目標(biāo)基因的密碼子序列。沒(méi)有過(guò)多的考慮不同組織和細(xì)胞中trna的豐度變化。為此，本發(fā)明提出一種根據(jù)trna表達(dá)特征提升蛋白質(zhì)生物合成效率的優(yōu)化方法。

4、密碼子優(yōu)化是指通過(guò)改變mrna序列中的密碼子，使其更適合宿主細(xì)胞的密碼子使用偏好，從而提高蛋白質(zhì)的翻譯效率。傳統(tǒng)密碼子的優(yōu)化策略就是用宿主細(xì)胞中使用頻率高的同義密碼子去替換外源mrna序列中的稀有密碼子，通過(guò)使用一系列定量方法來(lái)產(chǎn)生不同的mrna序列，用以減少核糖體在mrna上尋找匹配trna的時(shí)間，從而提升翻譯速率。其做法是以計(jì)算原始氨基酸序列在宿主細(xì)胞中密碼子適應(yīng)性指數(shù)(codon?adaptation?index，cai)為主要指標(biāo)并同時(shí)兼顧mrna二級(jí)結(jié)構(gòu)以及gc含量等優(yōu)化指標(biāo)對(duì)目標(biāo)基因的密碼子序列進(jìn)行優(yōu)化，以期提高其在翻譯過(guò)程中的速度和效率。雖然傳統(tǒng)密碼子優(yōu)化策略簡(jiǎn)單易行，但其存在一定的缺陷和不足：

5、(1)傳統(tǒng)方法通常以cai作為密碼子優(yōu)化的主要指標(biāo)，僅針對(duì)稀有密碼子進(jìn)行替換，無(wú)法全面考慮密碼子使用頻率、mrna結(jié)構(gòu)、trna豐度等多重因素，因此優(yōu)化效果有限；

6、(2)優(yōu)化后的序列含有宿主偏性密碼子，因此轉(zhuǎn)錄的mrna含有較高比例的密碼子亞群，從而導(dǎo)致不同trna的失衡，最終使得trna的消耗和翻譯的終止；

7、(3)傳統(tǒng)方法未考慮不同宿主細(xì)胞對(duì)密碼子的偏好性不同，優(yōu)化方式缺乏通用性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

2、本發(fā)明提供一種根據(jù)trna表達(dá)特征提升蛋白質(zhì)生物合成效率的方法，所述方法包含以下步驟：

3、(1)構(gòu)建樣本的trna-seq文庫(kù)；

4、(2)數(shù)據(jù)分析；

5、計(jì)算轉(zhuǎn)運(yùn)相同類型的氨基酸的trna所占各自比例，選取將同一同型trna中表達(dá)量最高的同工受體trna對(duì)應(yīng)的密碼子定義為高rsau密碼子；

6、(3)密碼子優(yōu)化

7、將待表達(dá)基因序列中低rsau密碼子替換成高rsau密碼子。

8、優(yōu)選地，所述步驟(1)中構(gòu)建trna-seq文庫(kù)具體包括trna的分離、預(yù)處理、雙接頭連接以及cdna的合成和文庫(kù)擴(kuò)增。

9、優(yōu)選地，所述步驟(2)中所述rsau的計(jì)算公式如下：

10、

11、優(yōu)選地，在步驟(1)中樣本為人類胚胎腎細(xì)胞系293t。

12、優(yōu)選地，在步驟(2)中所述高rsau密碼子分別為gct、agg、aac、gac、tgc、gag、cag、ggc、cac、att、ctg、aag、atg、ttc、cct、agc、aca、tgg、tac、gtg。

13、本發(fā)明的有益效果：

14、(1)優(yōu)化密碼子偏好性，提高同工trna使用效率，平衡密碼子和trna濃度，提高翻譯效率；

15、(2)考慮不同宿主的同工trna的表達(dá)量，使密碼子更適應(yīng)宿主細(xì)胞環(huán)境；

16、(3)不僅替換稀有密碼子，還考慮trna豐度，實(shí)現(xiàn)更全面的密碼子優(yōu)化。

技術(shù)特征：

1.一種根據(jù)trna表達(dá)特征提升蛋白質(zhì)生物合成效率的方法，其特征在于，所述方法包含以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中構(gòu)建trna-seq文庫(kù)具體包括trna的分離、預(yù)處理、雙接頭連接以及cdna的合成和文庫(kù)擴(kuò)增。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中所述rsau的計(jì)算公式如下：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(1)中樣本為人類胚胎腎細(xì)胞系293t。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中所述高rsau密碼子分別為gct、agg、aac、gac、tgc、gag、cag、ggc、cac、att、ctg、aag、atg、ttc、cct、agc、aca、tgg、tac、gtg。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種根據(jù)tRNA表達(dá)特征提升蛋白質(zhì)生物合成效率的方法。本發(fā)明提供一種根據(jù)tRNA表達(dá)特征提升蛋白質(zhì)生物合成效率的方法，所述方法包含以下步驟：(1)構(gòu)建樣本的tRNA?seq文庫(kù)(2)選取將同一同型tRNA中表達(dá)量最高的同工受體tRNA相應(yīng)的密碼子定義為高RSAU密碼子；(3)將高RSAU密碼子替換待表達(dá)基因序列中低RSAU密碼子。本發(fā)明的有益效果：(1)優(yōu)化密碼子偏好性，提高同工tRNA使用效率，平衡密碼子和tRNA濃度，提高翻譯效率；(2)考慮不同宿主的同工tRNA的表達(dá)量，使密碼子更適應(yīng)宿主細(xì)胞環(huán)境；(3)不僅替換稀有密碼子，還考慮tRNA豐度，實(shí)現(xiàn)更全面的密碼子優(yōu)化。

技術(shù)研發(fā)人員：王奕蓉,于峰,程慧敏,蔡子欣,舒淙瑤
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2