本發(fā)明涉及抗體工程，具體涉及一種抗犬瘟熱病毒的基因工程嵌合抗體及應用。

背景技術：

1、犬瘟熱病毒(canine?distemper?virus，cdv)屬于副粘病毒科，麻疹病毒屬，犬瘟熱病毒感染常引起呼吸道、消化道、尿道、淋巴系統、神經系統、皮膚等全身系統性的臨床癥狀。其感染的宿主非常多，可以感染犬科、原蠅科、鼬科、熊科、貓科等許多動物，在野生動物中存在跨物種感染、傳播，在家養(yǎng)動物中，不同物種之間也存在相互交叉感染。發(fā)病率100％，死亡率80％以上，已成為危害養(yǎng)犬業(yè)和經濟動物養(yǎng)殖業(yè)的重要傳染病之一。

2、目前預防該病使用的疫苗多為弱毒苗，但是許多犬、水貂、狐等養(yǎng)殖場在應用弱毒疫苗后仍會發(fā)生本病。分析原因，與母源抗體、疫苗效價、使用方法以及病毒變異有關。用弱毒疫苗免疫動物也未能得到完全保護，有許多免疫動物群體暴發(fā)犬瘟熱，損失十分慘重。對于犬瘟熱病毒感染，目前尚沒有特效藥物，臨床上多采用對癥治療、支持療法和特異性療法聯合應用。其中，特異性療法，一般早期采用犬瘟熱病毒單克隆抗體及犬瘟熱病毒抗血清。但犬瘟熱病毒的高免血清制備成本較高，易傳播其它病毒，抗體中和效價參差不齊，難以標準化。臨床上采用的抗犬瘟熱病毒單克隆抗體為鼠源單克隆抗體，由于鼠源單克隆抗體注射至其他種源動物時易產生免疫排斥導致治療效果下降影響了臨床應用。

3、目前，市場上的犬瘟熱病毒單克隆抗體和抗血清具有較強的免疫原性，在治療過程中會存在副作用降低療效，限制了其臨床應用。因此，制備低免疫原性、高親和力、特異性強的單克隆抗體更有利于推動抗體藥物的大規(guī)模臨床應用。

4、同時對于大熊貓等物種，犬瘟熱危害也極大，目前對于大熊貓患犬瘟熱的治療目前尚沒有特效藥物，急需要針對大熊貓源犬瘟熱疾病的治療藥物。

技術實現思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種抗犬瘟熱病毒的基因工程嵌合抗體及應用。本發(fā)明的抗犬瘟熱病毒基因工程嵌合抗體中的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列由犬瘟熱病毒h蛋白單克隆抗體9-7b提供，輕鏈和重鏈恒定區(qū)序列由犬源抗體或大熊貓源抗體提供。該基因工程嵌合抗體，能夠特異性的識別犬瘟熱病毒，對犬瘟熱病毒有高親和力，低免疫原性的優(yōu)點。

2、為實現上述目的，本發(fā)明所設計的技術方案如下：

3、本發(fā)明提供了一種抗犬瘟熱病毒的基因工程嵌合抗體，所述基因工程嵌合抗體包括鼠-犬嵌合抗體或鼠-大熊貓嵌合抗體；所述鼠-犬嵌合抗體的重鏈氨基酸序列如seq?idno：6所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no：8所示；所述鼠-大熊貓嵌合抗體的重鏈氨基酸序列如seq?id?no：10所示，輕鏈氨基酸序列如seq?id?no：12所示。

4、進一步地，所述鼠-犬嵌合抗體和鼠-大熊貓嵌合抗體均包括鼠源抗體的可變區(qū)；

5、且鼠-犬嵌合抗體還包括犬源抗體的恒定區(qū)，犬源抗體的恒定區(qū)包括重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，

6、犬源抗體的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：13所示，

7、犬源抗體的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：14所示；

8、鼠-大熊貓嵌合抗體還包括大熊貓源抗體的恒定區(qū)，大熊貓源抗體的恒定區(qū)包括重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)，

9、大熊貓源抗體重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：15所示，

10、大熊貓源抗體輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：16所示。

11、再進一步地，所述鼠源抗體的可變區(qū)包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，

12、鼠源抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：2所示，

13、鼠源抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no：4所示。

14、再進一步地，所述鼠-犬嵌合抗體和鼠-大熊貓嵌合抗體中均包括kozak序列和信號肽序列；

15、所述kozak序列的核苷酸序列如seq?id?no：17所示；所述信號肽序列的核苷酸序列如seq?id?no：18所示。

16、本發(fā)明還提供了一種編碼所述抗犬瘟熱病毒的基因工程嵌合抗體的基因，編碼所述鼠-犬嵌合抗體的重鏈的核苷酸序列如seq?id?no：5所示，編碼所述鼠-犬嵌合抗體的輕鏈的核苷酸序列如seq?id?no：7所示；

17、編碼所述鼠-大熊貓嵌合抗體的重鏈的核苷酸序列如seq?id?no：9所示，編碼所述鼠-大熊貓嵌合抗體的輕鏈的核苷酸序列如seq?id?no：11所示。

18、本發(fā)明還提供了一種所述基因工程嵌合抗體的制備方法，包括以下步驟：

19、(1)將鼠源抗體重鏈可變區(qū)和犬源/大熊貓源抗體重鏈恒定區(qū)相連，添加kozak序列和信號肽序列，鼠源抗體輕鏈可變區(qū)和犬源/大熊貓源抗體輕鏈恒定區(qū)相連，添加kozak序列和信號肽序列，進行cho密碼子優(yōu)化，得到嵌合抗體重鏈和嵌合抗體輕鏈；

20、(2)將嵌合抗體重鏈和嵌合抗體輕鏈分別構建入cho表達系統的表達載體中，進行融合轉化，獲得鼠-犬嵌合抗體質?；蚴?大熊貓嵌合抗體質粒；

21、(3)將鼠-犬嵌合抗體質粒和鼠-大熊貓嵌合抗體質粒分別轉染cho細胞系，篩選高表達細胞系，篩選單克隆細胞株，細胞株進行高密度表達純化，獲得鼠-犬嵌合抗體或鼠-大熊貓嵌合抗體。

22、進一步地，所述步驟(1)中，重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)位于重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)的n端；kozak序列和信號肽序列添加在重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的n端。

23、再進一步地，所述步驟(2)中，所述表達載體為pxc17.4。

24、本發(fā)明還提供了一種所述基因工程嵌合抗體在制備防治犬瘟熱病毒產品中的應用，所述產品中，鼠-犬嵌合抗體的濃度為1～2mg/ml或/和鼠-大熊貓嵌合抗體的濃度為3～4mg/ml。

25、進一步地，所述鼠-犬嵌合抗體的濃度為1.5mg/ml或/和鼠-大熊貓嵌合抗體的濃度為3.5mg/ml。

26、本發(fā)明的有益效果：

27、1、本發(fā)明的抗犬瘟熱病毒基因工程嵌合抗體中的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列由犬瘟熱病毒h蛋白單克隆抗體雜交瘤細胞9-7b株提供，輕鏈和重鏈恒定區(qū)序列由犬源抗體或大熊貓源抗體提供。犬瘟熱病毒h蛋白單克隆抗體9-7b，是以cho系統表達的重組h蛋白為免疫原免疫balb/c小鼠，通過雜交瘤技術篩選而來，其生物學性能十分優(yōu)良，不僅對犬瘟熱h蛋白和犬瘟熱病毒具有高親和力，還對犬瘟熱疫苗毒及我國流行的亞洲1型毒株具有良好的中和效果。

28、2、本發(fā)明的抗犬瘟熱病毒抗體9-7b的重鏈、輕鏈的可變區(qū)氨基酸序列和核苷酸序列，為構建高親和力、低免疫原性的抗犬瘟熱病毒的基因工程嵌合抗體提供支持。

29、3、本發(fā)明將抗犬瘟熱病毒抗體9-7b的可變區(qū)序列與犬源和大熊貓源恒定區(qū)進行組裝，得到抗犬瘟熱病毒的基因工程抗體，對犬瘟熱疫苗毒和野生毒株表現出良好的中和cdv病毒的活性，可將其應用于犬瘟熱病毒單克隆抗體犬源化和大熊貓源化研究等領域，對推動犬源化和大熊貓源化單克隆抗體藥物的發(fā)展具有重要意義。

30、4、在本發(fā)明中，運用的生產技術成熟，操作簡單，制備周期短。通過該技術生產的重組犬源和大熊貓源抗體具有較高的特異性和純度、穩(wěn)定的重復性以及低廉的生產成本等優(yōu)點。