本發(fā)明涉及基因工程與蛋白材料領(lǐng)域，具體涉及一種雜合貽貝蛋白的構(gòu)建方法與發(fā)酵制備方法。

背景技術(shù)：

1、貽貝足蛋白(mussel?foot?proteins,mfps)，又稱貽貝黏附蛋白，是地中海貽貝(mytilus?galloprovincalis)、厚殼貽貝(mytilus?coruscus)、翡翠貽貝(perna?viridis)等海洋貽貝足絲分泌的黏附物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了6種類型的mfps(mfp-1～mfp-6)，貽貝足蛋白具有粘附范圍廣、強(qiáng)度高、生物親和性好等特點(diǎn)，是研究生物濕粘附的重要仿生對(duì)象和創(chuàng)新策略的來(lái)源。

2、天然貽貝蛋白的提取十分困難，基因工程為貽貝蛋白的生產(chǎn)提供了新的方法，mfps在真核和原核宿主中都實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。然而，重組mfps仍然存在一些問(wèn)題，比如毒性可溶性表達(dá)導(dǎo)致的低產(chǎn)量、純化效率低、溶解度差等等。為了克服這些缺陷，研究人員構(gòu)建了多種由fp-1、fp-3和fp-5組成的新型雜合貽貝蛋白。蛋白主要表達(dá)為包涵體，并且較長(zhǎng)的編碼序列占用了更多的翻譯資源，導(dǎo)致三片段雜合蛋白fp-151、fp-131和fp-353的產(chǎn)量比單一蛋白高，fp-151在200l補(bǔ)料間歇式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，獲得了約為1g/l的重組貽貝蛋白產(chǎn)量，也有研究人員優(yōu)化了純化方法獲得了純品率為0.7g/l的fp-151，這是目前已知的最高表達(dá)和純化產(chǎn)量。此外，在不同的二片段融合蛋白fp-33、fp-35、fp-31中，由fp-3和fp-5組成的融合蛋白具有最好的粘附性能，這可能是3型和5型蛋白本身具有優(yōu)異的粘附力因此在結(jié)合后展現(xiàn)出最強(qiáng)粘附力。然而，對(duì)于粘附力最為優(yōu)異的3型和5型蛋白，并未有系列設(shè)計(jì)融合蛋白且大批量生產(chǎn)的報(bào)道。

3、因此，基于貽貝蛋白的多片段雜合，開發(fā)一種新的高粘性高產(chǎn)量的貽貝蛋白生產(chǎn)工藝具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雜合貽貝蛋白及其構(gòu)建方法和發(fā)酵制備方法。本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建串聯(lián)多拷貝貽貝蛋白的質(zhì)粒，以大腸桿菌為宿主，表達(dá)并獲得不同系列的雜合貽貝蛋白，提供了上述雜合貽貝蛋白黏附性能對(duì)比的方法，提供上述雜合貽貝蛋白的發(fā)酵工藝優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)高粘性貽貝蛋白的高水平生產(chǎn)。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開了一種雜合貽貝蛋白及其構(gòu)建方法與發(fā)酵制備方法。具體技術(shù)方案如下：

3、一種雜合貽貝蛋白，其含有一個(gè)3型貽貝蛋白和一個(gè)或兩個(gè)5型貽貝蛋白。優(yōu)選地，所述的雜合貽貝蛋白為下述a1～a4中的任意一種：

4、a1，從n端到c端依次含有5型貽貝蛋白、3型貽貝蛋白和5型貽貝蛋白(fp-535)；

5、a2，從n端到c端依次含有5型貽貝蛋白、5型貽貝蛋白和3型貽貝蛋白(fp-553)；

6、a3，從n端到c端依次含有3型貽貝蛋白和5型貽貝蛋白(fp-35)；

7、a4，從n端到c端依次含有5型貽貝蛋白和3型貽貝蛋白(fp-53)。

8、其中，所述的3型貽貝蛋白為來(lái)源于地中海貽貝mytilus?galloprovincalis的3b型蛋白mgfp-3b或mgfp-3b的突變體3bm；所述的地中海貽貝為野生型地中海貽貝。優(yōu)選地，所述的3bm包括對(duì)mgfp-3b進(jìn)行突變的單突變體和組合突變體，所述的單突變體為g33y、n43y或n76y中的任意一種，所述的組合突變體為兩兩突變和三三突變獲得的g33y/n43y、n43y/n76y、g33y/n76y或g33y/n43y/n76y中的任意一種。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的mgfp-3b和3bm的具體氨基酸序列和核苷酸序列詳見(jiàn)專利號(hào)為cn115181169a的中國(guó)專利。更優(yōu)選地，所述的3型貽貝蛋白為3bm組合突變體g33y/n43y/n76y，其粘附力最佳。

9、所述的5型貽貝蛋白來(lái)源于野生型地中海貽貝mytilus?galloprovincalis，命名為mgfp-5，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

10、其中，a1～a4所示的雜合貽貝蛋白的氨基酸序列順序如seq?id?no.2～5所示，編碼基因序列順序如seq?id?no.6～9所示。

11、第二方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)盒或重組表達(dá)載體，所述表達(dá)盒或表達(dá)載體含有第一方面所述的雜合貽貝蛋白的編碼基因序列。優(yōu)選地，所述的重組表達(dá)載體為pet28a-mgfp-3b、pet28a-mgfp-3bm(fp-3)、pet28a-mgfp-5(fp-5)、pet28a-mgfp-35(fp-35)、pet28a-mgfp-53(fp-53)、pet28a-mgfp-535(fp-535)、pet28a-mgfp-553(fp-553)或pacycduet-mgfp-535。

12、第三方面，本發(fā)明提供了含有第二方面所述的表達(dá)盒或重組表達(dá)載體的重組大腸桿菌。優(yōu)選地，所述的重組菌的出發(fā)菌為大腸桿菌bl21(de3)。

13、第四方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的雜合貽貝蛋白的制備方法，包括如下步驟：

14、(1)擴(kuò)增雜合貽貝蛋白的編碼基因序列，導(dǎo)入表達(dá)載體中構(gòu)建重組表達(dá)載體；將所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中即得重組菌；

15、(2)將所述的重組菌的種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液經(jīng)提取純化即得雜合貽貝蛋白。

16、其中，步驟(1)中，所述的表達(dá)載體為pet28a、pacycduet-1、petduet-1、prsfduet-1中的任意一種；所述的重組表達(dá)載體中導(dǎo)入了一個(gè)或兩個(gè)拷貝的雜合貽貝蛋白的編碼基因。優(yōu)選地，步驟(1)的具體方法如下：fp-5蛋白基因由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，并連接至pet28a(+)載體，得到pet28a-fp-5質(zhì)粒，接著，

17、(1)利用限制性內(nèi)切酶sal?i和xho?i酶切，從pet28a-fp-5中分離出fp-5基因，并連接到xho?i單酶切的pet28a-fp-3中，得到質(zhì)粒pet28a-fp-35；

18、(2)利用限制性內(nèi)切酶sal?i和xho?i酶切，從pet28a-fp-3中分離出fp-3基因，并連接到xho?i單酶切的pet28a-fp-5中，得到質(zhì)粒pet28a-fp-53；

19、(3)利用限制性內(nèi)切酶sal?i和xho?i酶切，從pet28a-fp-35中分離出fp-35基因，并連接到xho?i單酶切的pet28a-fp-5中，得到質(zhì)粒pet28a-fp-535；

20、(4)利用限制性內(nèi)切酶sal?i和xho?i酶切，從pet28a-fp-53中分離出fp-53基因，并連接到xho?i單酶切的pet28a-fp-5中，得到質(zhì)粒pet28a-fp-553；

21、(5)以pet28a-fp-535為模板，擴(kuò)增出fp-535片段，連接到nco?i和eco?ri酶切的pacycduet-1載體中，得到第一質(zhì)粒，隨后分別用nde?i和kpn?i酶切第一質(zhì)粒得到第一線性載體。以pet28a-fp-535為模板，擴(kuò)增出fp-535片段，連接到上述第一線性載體中，獲得含有兩個(gè)fp-535片段的質(zhì)粒pacycduet-2×fp535。

22、所得質(zhì)粒均轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主大腸桿菌e.coli?bl21(de3)，得到重組菌。

23、其中，步驟(2)中，所述的接種，接種體積比為10％-20％；所述的發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為32～37℃，發(fā)酵ph為6.5～7.5，總發(fā)酵時(shí)間為12～16h，溶氧為20～40％，通氣量2～5l/min，在發(fā)酵至菌液的od600為30～50時(shí)加入0.1～1.2mm異丙基-β-d-硫代半乳糖苷iptg誘導(dǎo)發(fā)酵4～8h；當(dāng)初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源耗盡，以30～60ml/h的流速加入補(bǔ)料培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述的重組菌的種子液，將重組菌接種至種子培養(yǎng)基中逐級(jí)放大培養(yǎng)，獲得種子液。

24、其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽；優(yōu)選地，所述的碳源為葡萄糖、甘油、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、木糖和水溶性淀粉中的任意一種或多種的組合；所述的氮源為蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米漿干粉中的任意一種或多種的組合；所述的無(wú)機(jī)鹽為硫酸鎂和磷酸二氫鉀中的任意一種或多種的組合；

25、優(yōu)選地，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：10～30g/l甘油，20～40g/l酵母粉，10～30g/l蛋白胨，0.5～2g/l硫酸鎂，2～8g/l磷酸二氫鉀；

26、所述的補(bǔ)料培養(yǎng)基為50～500g/l的葡萄糖水溶液。

27、優(yōu)選地，步驟(2)中，所述的提取，為柱層析或酸提取。優(yōu)選為柱層析。

28、其中，柱層析的具體方法為，將發(fā)酵所得菌體用裂解緩沖液(0.1mol/l?nah2po4，0.01mol/l?tris-cl，8mol/l尿素，ph＝8.0)重懸，超聲破碎后收取上清溶液，過(guò)膜后濾液與histrap?hp層析柱結(jié)合，用洗滌緩沖液(0.1mol/l?nah2po4，0.01mol/l?tris-cl，8mol/l尿素，ph＝5.9)洗滌雜質(zhì)，接著用洗脫緩沖液(0.5mol/l?hcl)收集目的蛋白，最后用5％(v/v)的乙酸透析后冷凍干燥。

29、酸提取的具體方法為，將發(fā)酵所得菌體溶于pbs緩沖液，超聲破碎后收取沉淀，先用25％(v/v)的乙酸過(guò)夜提取貽貝蛋白，最后用5％(v/v)的乙酸透析純化后冷凍干燥。

30、進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供了貽貝蛋白粘附性能的對(duì)比方法，具體包括玻璃搭接實(shí)驗(yàn)和afm成像。

31、其中，所述玻璃搭接實(shí)驗(yàn)步驟為：將純化的5mg貽貝蛋白溶于10μl?5％(v/v)乙酸中，均勻涂抹于玻璃基板的頂端后在37℃過(guò)夜粘合。搭接剪切實(shí)驗(yàn)使用萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行。

32、其中，afm成像實(shí)驗(yàn)步驟為：將純化的貽貝蛋白以終濃度為1mg/ml溶于5％(v/v)乙酸中，取10μl滴于云母表面，在室溫干燥后，用afm掃描蛋白質(zhì)包被的云母片的高度圖和相圖。然后將云母片在純水中沖洗4h后，用同樣的方法觀察云母表面殘留的蛋白。使用nanoscope軟件計(jì)算沖洗前后云母表面的顆粒覆蓋率和粗糙度。優(yōu)選的，黏附性能和涂覆力最強(qiáng)的雜合貽貝蛋白均為fp-535，黏附強(qiáng)度達(dá)到1.43mpa。

33、第五方面，本發(fā)明提供了第一方面所述的雜合貽貝蛋白在日用護(hù)膚、生物粘合和防水涂層方面的應(yīng)用。

34、有益效果：

35、本發(fā)明提供了一種雜合貽貝蛋白及其構(gòu)建和發(fā)酵制備方法，通過(guò)連接多個(gè)蛋白質(zhì)片段增強(qiáng)了貽貝蛋白的表達(dá)量和粘性，并在搖瓶和發(fā)酵罐上進(jìn)行了發(fā)酵工藝優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的高密度發(fā)酵工藝高效合成高粘性貽貝蛋白。雜合蛋白fp-535具有優(yōu)秀的涂覆力，黏附強(qiáng)度達(dá)到1.43mpa，在5l發(fā)酵罐上發(fā)酵12～14h的od600達(dá)到55～65，產(chǎn)量可達(dá)到1.5～2.0g/l。本發(fā)明建立的發(fā)酵工藝和純化工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)貽貝蛋白奠定了基礎(chǔ)。