本發(fā)明屬于基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種用于評(píng)估腦卒中患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，為腦卒中預(yù)后提供指導(dǎo)建議的引物探針組及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、腦卒中是一類病因復(fù)雜、致死率、復(fù)發(fā)率高的疾病，在過去30年里，我國腦卒中發(fā)病率急劇攀升，并已躍升為我國國民的第一位死因。腦卒中包括缺血性腦卒中(ischemicstroke,is)和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占所有腦卒中的65％-85％。is的急性患者多起病突然、病情重且進(jìn)展迅速，短時(shí)間內(nèi)即可造成神經(jīng)系統(tǒng)功能的永久性、不可逆損傷，嚴(yán)重影響其預(yù)后及生存質(zhì)量。既往發(fā)生過is或有一過性短暫性腦缺血(transientischemic?attack,tia)病史的患者，再次發(fā)生is的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高，且復(fù)發(fā)后的病情更為兇險(xiǎn)，致殘率、病死率更高。以缺血性卒中為例，其3個(gè)月的復(fù)發(fā)率、致殘率、死亡率數(shù)據(jù)如下：

2、

3、克隆性造血(clonal?haematopoiesis,ch)泛指存在源自突變的多能干/祖細(xì)胞的細(xì)胞群，在沒有無法解釋的血細(xì)胞減少、血液癌癥或其他克隆性疾病的情況下具有選擇性生長優(yōu)勢(shì)。

4、2023年who淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類正式引入了“克隆性造血(clonalhaematopoiesis)”這一概念，其定義為骨髓和/或外周血存在來源于突變的多潛能干細(xì)胞/祖細(xì)胞且具有優(yōu)勢(shì)增生能力的血細(xì)胞群，該人群沒有原因不明的血細(xì)胞減少、造血系統(tǒng)腫瘤及其它克隆性疾病，其發(fā)病率隨年齡的增加而增高。也有學(xué)者稱之為潛能未定的克隆性造血(clonal?haematopoiesis?ofindeterminate?potential，chip)。

5、bhattacharya?r(clonal?hematopoiesis?is?associatedwith?higher?riskofstroke.stroke.2022mar；53(3):788-797.doi:10.1161/strokeaha.121.037388.epub2021nov?8.)等的研究表明克隆造血與卒中高風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，但作者僅是基于已有數(shù)據(jù)進(jìn)行了一般性闡述，未做深入研究。xin?qiu(qiu?x,dai?y,cheng?s,et?al.somaticmutation?contributing?to?clonal?haematopoiesis?is?a?risk?factor?ofrecurrentstroke?in?first-ever?acute?ischaemic?stroke:aprospective?cohort?study.stroke&vascularneurology?2023；8:e001756.doi:10.1136/svn-2022-001756)等基于6016例首次卒中患者的研究認(rèn)為體細(xì)胞突變(chip)的增加了卒中復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，但作者使用的是whole-genome?sequencing(wgs)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，該方法檢測(cè)成本高，流程長，不利于大規(guī)模推廣和普及。

6、目前腦卒中預(yù)后的最強(qiáng)的預(yù)測(cè)指標(biāo)是腦卒中嚴(yán)重程度和患者年齡。根據(jù)神經(jīng)功能缺損程度(例如神志、語言、行為改變，視野缺損和運(yùn)動(dòng)障礙)及mri或ct神經(jīng)影像學(xué)上梗死灶的大小和位置，可從臨床上判斷腦卒中的嚴(yán)重程度。腦卒中結(jié)局的其他重要影響因素包括缺血性腦卒中機(jī)制、共存疾病、流行病學(xué)因素及腦卒中并發(fā)癥。目前臨床上仍缺乏有效的is療效監(jiān)控及預(yù)后判斷血液學(xué)指標(biāo)，現(xiàn)有卒中預(yù)后的指標(biāo)中亦沒有納入基因?qū)W的檢測(cè)指標(biāo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于腦卒中患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后評(píng)估的引物探針組及試劑盒。特別地，設(shè)計(jì)一種基于隆性造血相關(guān)基因突變的檢測(cè)試劑盒，用于腦卒中的預(yù)后評(píng)估。

2、本發(fā)明提供了一種用于腦卒中患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后評(píng)估的引物探針組，所述引物探針組針對(duì)的基因包括u2af1、gnb1、tet2、dnmt4a、tp53、jak2、sf3b1基因，確定所述基因的突變位點(diǎn)。

3、優(yōu)選地，所述基因的突變位點(diǎn)分別為：u2af1基因的位點(diǎn)c.470a>g，gnb1基因的位點(diǎn)c.233a>g，tet2基因的位點(diǎn)c.3088c>t，dnmt4a基因的位點(diǎn)c.2098c>t，tp53基因的位點(diǎn)c.848g>a，jak2基因的位點(diǎn)c.1849g>t，sf3b1基因的位點(diǎn)c.1996a>c。

4、優(yōu)選地，所述u2af1基因的c.470a>g的擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no?1和seq?id?no?2所示；

5、優(yōu)選地，所述gnb1基因的c.233a>g的擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no?3和seq?id?no?4所示；

6、優(yōu)選地，所述tet2基因c.3088c>t的擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no?5和seq?id?no?6所示；

7、優(yōu)選地，所述dnmt4a基因c.2098c>t的擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no?7和seq?id?no?8所示；

8、優(yōu)選地，所述tp53基因c.848g>a的擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no?9和seqid?no?10所示；

9、優(yōu)選地，所述jak2基因c.1849g>t的擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no?11和seq?id?no?12所示；

10、優(yōu)選地，所述sf3b1基因c.1996a>c的擴(kuò)增引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no?13和seq?id?no?14所示。

11、優(yōu)選地，所述u2af1基因的c.470a>g的突變型探針的核苷酸序列如seq?id?no?15所示，野生型探針的核苷酸序列如seq?id?no?16；

12、優(yōu)選地，所述gnb1基因的c.233a>g的突變型探針的核苷酸序列如seq?id?no?17所示，野生型探針的核苷酸序列如seq?id?no?18；

13、優(yōu)選地，tet2基因c.3088c>t的突變型探針的核苷酸序列如seq?id?no?19所示，野生型探針的核苷酸序列如seq?id?no?20；

14、優(yōu)選地，所述dnmt4a基因c.2098c>t的突變型探針的核苷酸序列如seq?id?no?21所示，野生型探針的核苷酸序列如seq?id?no?22；

15、優(yōu)選地，所述tp53基因c.848g>a的突變型探針的核苷酸序列如seq?id?no?23所示，野生型探針的核苷酸序列如seq?id?no?24所示；

16、優(yōu)選地，所述jak2基因c.1849g>t的突變型探針的核苷酸序列如seq?id?no?25所示，野生型探針的核苷酸序列如seq?id?no?26所示；

17、優(yōu)選地，所述sf3b1基因c.1996a>c的突變型探針的核苷酸序列如seq?id?no?27所示，野生型探針的核苷酸序列如seq?id?no?28所示。

18、優(yōu)選地，所述探針核苷酸序列的5’端用fam或vic標(biāo)記，所述3’端用mgb標(biāo)記。

19、本發(fā)明還提供了一種用于腦卒中患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后評(píng)估的試劑盒，所述試劑盒包括任一所述引物探針組。

20、進(jìn)一步優(yōu)選地，突變型探針核苷酸序列5’端用fam標(biāo)記；野生型探針核苷酸序列5’端用vic標(biāo)記。

21、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括pcr擴(kuò)增試劑、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。

22、優(yōu)選地，所述陽性質(zhì)控品包括第一陽性質(zhì)控品、第二陽性質(zhì)控品和第三陽性質(zhì)控品；其中第一陽性質(zhì)控品為位點(diǎn)純合野生型質(zhì)?；旌弦?；所述第二陽性質(zhì)控品為位點(diǎn)雜合野生型和突變型質(zhì)粒混合液；所述第三陽性質(zhì)控品為位點(diǎn)純合突變型質(zhì)粒混合液；所述陰性質(zhì)控品為水。

23、本發(fā)明還提供一種snp位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括：(1)提取待測(cè)樣品人基因組dna；(2)實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增；(3)結(jié)果判斷。

24、具體方法如下：

25、(1)提取外周血樣本dna，采用核酸提取盒提取待測(cè)樣品人基因組dna；

26、(2)實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)：所述引物探針組合物4μl，所述pcr反應(yīng)酶體系12.5μl，模板dna2μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μl。其中模板，以(1)中樣本dna為模板作為待測(cè)樣本；所述純化水為模板作為陰性對(duì)照；所述純合野生型核酸片段、雜合突變型核酸片段、純合突變型核酸片段分別為模板作為陽性對(duì)照。將陰性和陽性對(duì)照與待測(cè)樣本按照相同的反應(yīng)過程進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，以驗(yàn)證檢測(cè)的有效性。

27、(3)實(shí)時(shí)熒光pcr儀擴(kuò)增：按照①60℃×1min，95℃×10min(1cycle)；②95℃×15sec，60℃×30sec(50cycles，60℃采集熒光，熒光通道選擇fam、vic)；

28、(4)結(jié)果判斷：優(yōu)選的，使用abi?7500等儀器進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)并讀取檢測(cè)結(jié)果。樣本的檢測(cè)結(jié)果按照以下判讀標(biāo)準(zhǔn)判讀：野生型為等位基因分型散點(diǎn)圖上的紅色圖形(靠近x軸)，雜合突變型為等位基因分型散點(diǎn)圖上的綠色圖形(靠近對(duì)角線)，純合突變型為等位基因分型散點(diǎn)圖上的藍(lán)色圖形(靠近y軸)。

29、本發(fā)明提供一種生物標(biāo)志物在制備腦卒中患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后評(píng)估的試劑中的應(yīng)用，其特征在于，所述生物標(biāo)志物包括u2af1基因的c.470a>g、gnb1基因的c.233a>g、tet2基因c.3088c>t，dnmt4a基因的c.2098c>t，tp53基因的c.848g>a，jak2基因的c.1849g>t，sf3b1基因的c.1996a>c中的一種或幾種。

30、本發(fā)明提供一種任一所述引物探針組或任一所述試劑盒在制備腦腦卒中患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后評(píng)估的應(yīng)用。

31、本發(fā)明的原理如下：

32、第一方面，本發(fā)明提供腦卒中相關(guān)基因的snp位點(diǎn)。所述基因位點(diǎn)為：u2af1基因的c.470a>g位點(diǎn)、gnb1基因的c.233a>g位點(diǎn)、tet2基因c.3088c>t位點(diǎn)，dnmt4a基因的c.2098c>t位點(diǎn)，tp53基因的c.848g>a位點(diǎn)，jak2基因的c.1849g>t位點(diǎn)，sf3b1基因的c.1996a>c位點(diǎn)，所述的基因檢測(cè)位點(diǎn)和rs號(hào)的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下所示：

33、

34、

35、第二方面，本發(fā)明提供檢測(cè)以上靶點(diǎn)的引物和探針組合。根據(jù)所選擇的腦卒中相關(guān)易感基因序列，設(shè)計(jì)出特異性的針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增的上下游引物，其位置選在距離該突變位點(diǎn)前和后20-100個(gè)堿基左右，但不包含該突變位點(diǎn)的dna序列上，上游引物在3'端具有起始密碼子以及與模板序列完全匹配的至少15個(gè)堿基，下游引物包括終止密碼子在內(nèi)和模板序列的至少15個(gè)反向互補(bǔ)序列；

36、選取突變位點(diǎn)前/后3-25個(gè)堿基，但不與上下游引物重合的位置，探針長度在13-30bp之間，gc含量控制在40％-60％之間，避免連續(xù)相同片段的出現(xiàn)，tm值在65-70℃之間，同一個(gè)位點(diǎn)的野生型和突變型靶標(biāo)探針的5’端采用2種不同熒光基團(tuán)標(biāo)示，突變型探針選取fam基團(tuán)插入熒光信號(hào)，野生型探針選擇vic基團(tuán)作為插入熒光信號(hào)。在探針的3’端加入mgb淬滅熒光基團(tuán)；

37、第三方面，本發(fā)明提供含有腦卒中預(yù)后相關(guān)的snp位點(diǎn)檢測(cè)的引物與探針組合物的試劑盒。該試劑盒可特異快速準(zhǔn)確地進(jìn)行多個(gè)腦卒中相關(guān)易感基因多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，為腦卒中的預(yù)后提供臨床輔助診斷依據(jù)。

38、所述試劑盒包括第一檢測(cè)組和第二檢測(cè)組；所述第一檢測(cè)組包括本發(fā)明上述所述的引物探針組合組；所述第二檢測(cè)組包括pcr反應(yīng)液酶體系。

39、優(yōu)選地，第二檢測(cè)組pcr反應(yīng)液包括緩沖液、mg2+和dntps和熱啟動(dòng)taq酶體系；

40、所述試劑盒還包括陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。所述陽性質(zhì)控品包括陽性質(zhì)控品1、陽性質(zhì)控品2和陽性質(zhì)控品3；所述陽性質(zhì)控品1為所有位點(diǎn)純合野生型質(zhì)?；旌弦海鲫栃再|(zhì)控品2為所有位點(diǎn)雜合突變型質(zhì)?；旌弦汉退鲫栃再|(zhì)控品3為所有位點(diǎn)純合突變型質(zhì)?；旌弦骸?yōu)選地，所述陰性質(zhì)控品為純化水。

41、第四方面，本發(fā)明還提供了一種腦卒中預(yù)后相關(guān)的snp位點(diǎn)基因突變?cè)噭┖械臋z測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：

42、(1)提取外周血樣本dna，采用核酸提取盒提取待測(cè)樣品人基因組dna；

43、(2)實(shí)時(shí)熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)：所述引物探針組合物4μl，所述pcr反應(yīng)酶體系12.5μl，模板dna2μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μl。其中模板，以(1)中樣本dna為模板作為待測(cè)樣本；所述純化水為模板作為陰性對(duì)照；所述純合野生型核酸片段、雜合突變型核酸片段、純合突變型核酸片段分別為模板作為陽性對(duì)照。將陰性和陽性對(duì)照與待測(cè)樣本按照相同的反應(yīng)過程進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，以驗(yàn)證檢測(cè)的有效性。

44、(3)實(shí)時(shí)熒光pcr儀擴(kuò)增：按照①60℃×1min，95℃×10min(1cycle)；②95℃×15sec，60℃×30sec(50cycles，60℃采集熒光，熒光通道選擇fam、vic)；

45、(4)結(jié)果判斷：優(yōu)選的，使用abi?7500等儀器進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)并讀取檢測(cè)結(jié)果。樣本的檢測(cè)結(jié)果按照以下判讀標(biāo)準(zhǔn)判讀：野生型為等位基因分型散點(diǎn)圖上的紅色圖形(靠近x軸)，雜合突變型為等位基因分型散點(diǎn)圖上的綠色圖形(靠近對(duì)角線)，純合突變型為等位基因分型散點(diǎn)圖上的藍(lán)色圖形(靠近y軸)。

46、本發(fā)明公開了腦卒中相關(guān)基因u2af1、gnb1、tet2、dnmt4a、tp53、jak2、sf3b1對(duì)應(yīng)snp位點(diǎn)：c.470a>g、c.233a>g、c.3088c>t、c.2098c>t、c.848g>a、c.1849g>t、c.1996a>c及所述snp位點(diǎn)的等位基因分型檢測(cè)用引物、探針組合，屬于基因檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該方法主要采用taqman-mgb探針法對(duì)所述snp位點(diǎn)等位基因設(shè)計(jì)特異性的mgb探針。針對(duì)同一位點(diǎn)的野生型和突變型靶標(biāo)探針采用2種不同熒光基團(tuán)標(biāo)示，并對(duì)應(yīng)一組通用上游和下游序列，在同一管中進(jìn)行分型檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量pcr擴(kuò)增時(shí)在終點(diǎn)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行熒光信號(hào)掃描，對(duì)不同熒光信號(hào)進(jìn)行頻率和信號(hào)強(qiáng)弱分類，從而分析出該位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的snp靶標(biāo)。利用本發(fā)明的引物、探針組合進(jìn)行檢測(cè)具有簡便快速、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于同一樣本進(jìn)行多個(gè)snp位點(diǎn)檢測(cè)尤其便利，為腦卒中患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后評(píng)估提供證據(jù)支持。

47、有益效果

48、本發(fā)明提供一個(gè)基于克隆性造血相關(guān)基因突變的聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，該試劑盒采用taqman-mgb探針，具有靈敏度高，特異性好、易于操作和推廣使用等優(yōu)勢(shì)，可用于腦卒中患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后評(píng)估。