本發(fā)明屬于肝纖維化疾病治療領域，具體涉及一種prss8?m6a修飾調控在肝纖維化疾病中的應用。

背景技術：

1、肝纖維化(liver?fibrosis,lf)是由多種致病因素引起的慢性持續(xù)性肝臟炎癥或損傷后組織修復過程中的代償反應。肝星狀細胞(hepatic?stellate?cell,hscs)活化是lf發(fā)病的核心事件，細胞外基質(extracellular?matrix,ecm)過度積聚為其主要病理特征。lf是各種慢性肝病進一步轉變?yōu)楦斡不?、肝癌的關鍵步驟，嚴重影響患者及其家庭的生活質量，已成為全球衛(wèi)生健康的一大挑戰(zhàn)。lf屬于可逆病變，及時進行有效的抗纖維化治療是防止慢性肝病向終末期肝病轉化的必要措施。然而，lf具體發(fā)病機制尚不完全明確，且暫無根治性藥物。因此，探究lf發(fā)病的分子學機制具有重要理論意義與臨床價值。

2、肝臟由肝實質細胞和非實質細胞組成。肝實質細胞是一種特化的上皮細胞，占肝臟總細胞數的80％以上，在肝臟中執(zhí)行包括蛋白質合成、脂質和碳水化合物代謝、體內異生物質的生物轉化和毒性降解等重要功能。非實質細胞包括巨噬細胞、枯否細胞、hscs、肝竇內皮細胞、免疫細胞等。hscs是肝纖維化過程中關鍵的非實質細胞，被炎癥細胞因子激活后，產生ⅰ型膠原蛋白，導致ecm過度沉積，致使lf發(fā)病。

3、n6-甲基腺嘌呤(n6-methyladenosine,m6a)修飾是指發(fā)生在堿基a第六位n原子上、動態(tài)可逆的甲基化過程，是真核生物中最為常見的一種rna轉錄后修飾。m6a修飾可在rna水平影響基因的轉錄、剪接、定位、翻譯、穩(wěn)定性和轉錄后調控。課題組前期通過m6a-seq和rna-seq，結合共表達分析、差異倍數、功能富集等標準，篩選出與lf發(fā)病相關，且m6a修飾和rna表達均存在顯著差異的關鍵mrna——絲氨酸蛋白酶8(serine?protease?8,prss8)。prss8是一種糖基磷脂酰肌醇錨定的絲氨酸蛋白酶，來源于16號染色體，基因組編號：31131433-31135727，全長4.3kb。

4、toll-樣受體4(toll-like?receptor?4,tlr4)位于細胞膜上，為i型跨膜受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)組成，是炎癥級聯反應的重要促進因子。炎癥級聯反應已被證實參與lf的病理過程，如可刺激hscs活化、增殖，促進lf的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現，活化后的炎癥小體可加重肝臟炎性反應，過度活化hscs，導致膠原纖維大量沉積，加速lf進程。因此，抑制lf過程中的炎癥級聯反應，會抑制hscs過度活化。

5、課題組認為肝纖維化的基本病機是“肝失條達，脈絡不和，氣機郁滯，脾失健運”，提出“疏肝解郁，健脾益氣”的治則，并創(chuàng)制了特色醫(yī)院制劑“疏肝健脾方(shuganjianpiformula,sgjpf)”。前期研究表明sgjpf可顯著改善lf模型肝臟損傷、膠原纖維沉積、降低炎癥因子表達水平。然而，sgjpf治療lf的具體分子機制和作用靶點尚不完全清楚。因此，進一步探究sgjpf治療lf的分子作用機制，可為lf的防治提供新的思路和見解。

技術實現思路

1、本發(fā)明以文獻調研和前期研究為基礎，原代肝實質細胞與hscs共培養(yǎng)模型為研究對象，prss8m6a修飾為切入點，tlr4介導炎癥級聯反應誘導hscs活化為靶點，利用多種現代手段，探討prss8?m6a修飾調控tlr4的表達，介導炎癥級聯反應，促進hscs過度活化，參與肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的機制及疏肝健脾方的干預作用，以期為臨床診療肝纖維化提供新的思路與潛在靶點。

2、本發(fā)明所采取的技術方案為：

3、本發(fā)明提出了一種prss8?m6a修飾調控在肝纖維化疾病中的應用，具體為：prss8m6a修飾會降低其mrna穩(wěn)定性，抑制prss8表達水平，促進tlr4表達，介導炎癥級聯反應，誘導hscs過度活化，參與肝纖維化發(fā)病。

4、同時，本發(fā)明還提出了一種抑制prss8?m6a修飾的制劑在制備肝纖維化治療制劑中的應用，具體為：抑制prss8?m6a修飾，減輕tlr4介導的炎癥級聯反應，抑制hscs活化，對肝纖維化發(fā)揮治療作用。

5、本發(fā)明通過建立肝纖維化小鼠動物模型，分離原代肝實質細胞與hscs，以兩種細胞共培養(yǎng)為研究對象，采用實時定量pcr法(rt-qpcr)、免疫蛋白印跡技術(wb)和rna甲基化免疫共沉淀pcr(merip-qpcr)等技術檢測肝實質細胞中prss8?mrna、蛋白表達水平和prss8m6a修飾水平；借助rmvar和sramp工具確定prss8?m6a修飾位點，并通過突變位點構建prss8m6a修飾位點突變模型；rt-qpcr、wb和merip-qpcr技術檢測prss8?m6a修飾位點突變后，肝實質細胞中prss8?mrna、蛋白表達水平和m6a修飾水平變化；細胞計數試劑盒(cck-8)和流式細胞術檢測prss8?m6a修飾位點突變后，對hscs增殖和周期的影響；rt-qpcr、wb技術檢測prss8?m6a修飾位點突變后，hscs活化標志物平滑肌肌動蛋白和ⅰ型膠原蛋白的表達水平；wb技術檢測炎癥級聯反應關鍵因子tlr4的表達水平；酶聯免疫吸附實驗檢測炎癥指標白細胞介素(il)-1β和il-18的表達水平；放線菌素d實驗檢測prss8?m6a修飾位點突變后，prss8mrna半衰期的變化；回復實驗驗證prss8?m6a修飾通過調控tlr4介導的炎癥級聯反應影響hscs功能表型，參與肝纖維化的發(fā)病。

6、同時，通過疏肝健脾方含藥血清干預，觀察sgjpf含藥血清對prss8?mrna、蛋白和m6a修飾水平、mrna半衰期的影響；觀察sgjpf含藥血清對hscs活化標志物、tlr4表達和炎癥指標的影響；通過協同驗證實驗，在prss8?m6a修飾位點突變基礎上，給予sgjpf含藥血清干預，觀察hscs增殖、細胞周期、活化標志物和炎癥指標的變化情況。

7、本發(fā)明通過實驗證實：

8、1、prss8?m6a修飾調控tlr4介導炎癥級聯反應，誘導hscs過度活化的機制研究

9、1.1肝纖維化小鼠原代肝實質細胞中prss8?m6a修飾、mrna和蛋白的表達情況

10、與對照組相比，模型組中prss8?m6a修飾水平在肝實質細胞中顯著升高，prss8mrna和蛋白在肝實質細胞中表達顯著降低。

11、1.2肝纖維化小鼠原代hscs功能表型

12、與對照組相比，模型組hscs活力顯著升高，g1期hscs數量顯著減少。

13、1.3肝纖維化小鼠原代hscs活化指標和肝實質細胞tlr4表達水平

14、與對照組相比，模型組hscs活化指標α-sma和collagen表達明顯升高，tlr4?mrna和蛋白表達顯著升高。

15、1.4肝纖維化小鼠細胞共培養(yǎng)上清液中炎癥指標il-1β和il-18表達水平的變化情況

16、與對照組相比，模型組il-1β和il-18表達顯著升高。

17、1.5prss8?m6a修飾位點突變后對prss8?mrna、蛋白和m6a修飾表達的影響

18、與prss8野生型相比，prss8?m6a修飾位點突變后，prss8?mrna和蛋白在肝實質細胞中表達上調，prss8?m6a修飾水平在肝實質細胞中表達下調。

19、1.6prss8?m6a修飾位點突變對hscs功能表型的影響

20、與prss8野生型相比，prss8?m6a修飾位點突變后，hscs活力降低，g1期細胞數增加。

21、1.7prss8?m6a修飾位點突變對hscs活化指標和tlr4表達水平的影響

22、與prss8野生型相比，prss8?m6a修飾位點突變后，hscs活化指標α-sma和collagenⅰ表達降低，tlr4?mrna和蛋白表達水平也顯著下降。

23、1.8prss8?m6a修飾位點突變后對細胞共培養(yǎng)上清液中炎癥指標il-1β和il-18的影響

24、與prss8野生型相比，prss8?m6a修飾位點突變后顯著下調il-1β和il-18的表達水平。

25、1.9prss8?m6a修飾位點突變對prss8?mrna穩(wěn)定性的影響

26、與prss8野生型相比，prss8?m6a修飾位點突變組中prss8?mrna穩(wěn)定性顯著降低。

27、1.10回復實驗

28、與模型組相比，prss8?m6a修飾位點突變后，顯著抑制hscs活力，增加g1期細胞數，降低α-sma和collagenⅰ表達水平，降低il-1β和il-18表達水平。與prss8?m6a修飾位點突變后相比，prss8?m6a修飾位點突變與上調tlr4共同干預后，可升高α-sma和collagenⅰ表達水平，增加hscs活力，減少g1期細胞數，上調il-1β和il-18表達水平。

29、2、疏肝健脾方調控prss8?m6a修飾，促進prss8表達，減輕tlr4介導的炎癥級聯反應，抑制hscs活化的機制研究

30、2.1sgjpf含藥血清對prss8?m6a修飾、mrna和蛋白表達的影響

31、與對照組相比，模型組中prss8?mrna和蛋白表達水平明顯下降；與模型組相比，sgjpf含藥血清組中prss8?mrna和蛋白表達水平明顯上升。而模型組prss8?m6a修飾水平比對照組顯著升高；sgjpf含藥血清組中prss8?m6a修飾水平比模型組明顯下降。

32、2.2sgjpf含藥血清對hscs活化標志物的影響

33、與對照組相比，模型組中α-sma和collagenⅰmrna和蛋白表達水平明顯上升；與模型組相比，sgjpf含藥血清組中α-sma和collagenⅰmrna和蛋白表達水平明顯下降。

34、2.3sgjpf含藥血清對tlr4?mrna和蛋白表達的影響

35、與對照組相比，模型組中tlr4?mrna和蛋白表達水平明顯上升；與模型組相比，sgjpf含藥血清組中tlr4的mrna和蛋白表達水平明顯下降。

36、2.4sgjpf含藥血清對細胞培養(yǎng)上清液中炎癥指標il-1β和il-18的影響

37、與對照組相比，模型組中il-1β和il-18水平明顯升高；與模型組相比，sgjpf含藥血清組中il-1β和il-18水平顯著降低。

38、2.5協同驗證實驗

39、與prss8野生型相比，prss8?m6a修飾位點突變后降低了hscs活力，增加g1期細胞數，降低了α-sma和collage?i的表達水平，降低il-1β和il-18表達水平。與prss8?m6a修飾位點突變后相比，prss8?m6a修飾位點突變和sgjpf含藥血清組協同干預下，更顯著降低了hscs活力，增加g1期細胞數，降低了α-sma、collage?i表達水平，降低了il-1β和il-18表達水平。

40、3、實驗結論

41、(1)prss8?m6a修飾可降低其mrna穩(wěn)定性，抑制prss8表達水平，促進tlr4表達，介導炎癥級聯反應，誘導hscs過度活化，參與lf發(fā)病。

42、(2)疏肝健脾方可降低prss8?m6a修飾，減輕tlr4介導的炎癥級聯反應，抑制hscs活化，對lf發(fā)揮治療作用。從而證實，抑制prss8?m6a修飾的制劑能夠發(fā)揮對肝纖維化治療作用。