本發(fā)明涉及生物工程，尤其是指一種利用葡萄糖二次母液制備葡萄糖結(jié)晶的方法。

背景技術(shù)：

1、淀粉是由葡萄糖脫去一分子水后經(jīng)糖苷鍵連接形成的共價(jià)聚合物，是一種高分子糖類。其基本構(gòu)成單元為α-d-葡萄糖。淀粉主要分為直鏈淀粉和支鏈淀粉兩類，脫水葡萄糖經(jīng)α-1,4-糖苷鍵連接的被稱為直鏈淀粉，支鏈淀粉的分子結(jié)構(gòu)比直鏈淀粉更為復(fù)雜，其主要是以α-1,4-糖苷鍵連接的主鏈，同時(shí)在分支點(diǎn)由α-1,6-糖苷鍵連接成多個(gè)分支結(jié)構(gòu)。

2、淀粉制糖發(fā)展歷史悠久，將淀粉原料經(jīng)過酸法或者酶法等制取的各種糖類，如葡萄糖、麥芽糖、低聚糖和果葡糖漿等，統(tǒng)稱為淀粉糖。葡萄糖是一種在自然界分布廣泛的單糖，工業(yè)上生產(chǎn)葡萄糖主要采用雙酶法，即淀粉經(jīng)過α-淀粉酶液化后再添加葡萄糖淀粉酶進(jìn)行糖化反應(yīng)。淀粉酶是指能作用于淀粉的酶，淀粉酶主要水解淀粉分子中糖苷鍵，目前工業(yè)上淀粉糖生產(chǎn)中使用的酶主要有：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和脫支酶等。其中脫支酶主要水解淀粉或者大分子糖原中的α-1,6-糖苷鍵，根據(jù)其對底物的特異性不同，將脫支酶分成支鏈淀粉酶、異淀粉酶和低聚糖脫支酶。葡萄糖淀粉酶主要作用淀粉中α-1,4-糖苷鍵，對α-1,6-糖苷鍵的水解效率非常緩慢；同時(shí)葡萄糖淀粉酶還具有轉(zhuǎn)糖苷活力，在糖化反應(yīng)后期葡萄糖濃度較高時(shí)催化葡萄糖聚合生成由α-1,6-糖苷鍵組成的異麥芽低聚糖。因此單一使用糖化酶時(shí)淀粉水解不夠徹底，副產(chǎn)物較多。

3、為了得到高純度葡萄糖漿，可以在糖化反應(yīng)中復(fù)配使用脫支酶，脫支酶負(fù)責(zé)水解底物中的分支點(diǎn)，為糖化酶提供更易水解的線性底物，加快糖化反應(yīng)速度，減少副產(chǎn)物生成，提高葡萄糖得率和純度。支鏈淀粉酶對相對分子質(zhì)量較小的糊精和普魯蘭多糖脫支效率高，對大分子淀粉脫支效率低。部分普魯蘭酶存在α-1,4-糖苷鍵水解活力，易產(chǎn)生較多副產(chǎn)物。異淀粉酶對相對分子質(zhì)量較大的支鏈淀粉以及分支密集的糖原脫支效率高，對小分子麥芽糊精脫支效率低。低聚糖脫支酶(oligo-1,6-glucosidase；ec?2.4.1.10)是一種能夠水解低聚糖分子間的α-1,6-糖苷鍵，進(jìn)而生成更多的小分子糖，但在工業(yè)上還亟需一種能夠水解小分子糖分子間的α-1,4-糖苷鍵的低聚糖脫支酶，以滿足工業(yè)上對麥芽低聚糖和異麥芽低聚糖水解的需求。目前的研究中低聚糖脫支酶大多是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)且?guī)缀醵荚诎麅?nèi)表達(dá)，這種表達(dá)系統(tǒng)獲取酶液困難、步驟繁瑣，效率低下，嚴(yán)重阻礙了低聚糖脫支酶的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌是一種在自然界普遍存在的革蘭氏陽性菌，由于其獨(dú)特的生理優(yōu)勢和食品級工程菌的身份，在多個(gè)產(chǎn)業(yè)如食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境和生物里被廣泛的使用。

4、在葡萄糖工業(yè)化生產(chǎn)工藝中，結(jié)晶的葡萄糖從結(jié)晶罐中分離出后剩余的反應(yīng)液被稱為葡萄糖母液，根據(jù)葡萄糖結(jié)晶次數(shù)的不同，可以將其分為一次母液、二次母液和色譜提余液。其中，一次母液會(huì)再次回到結(jié)晶罐再次結(jié)晶，但二次母液由于其葡萄糖含量低、二糖和三糖等小分子糖含量高而難以再次結(jié)晶，通常會(huì)將其出售，但由于每次結(jié)晶后會(huì)產(chǎn)生大量葡萄糖母液，導(dǎo)致葡萄糖母液價(jià)格偏低，市場價(jià)值受限，這與對廢棄物充分利用的循環(huán)綠色的理念相悖。在葡萄糖結(jié)晶過程中，葡萄糖母液中可能殘留些許色素和雜質(zhì)，這些成分對最終產(chǎn)品的質(zhì)量有著直接的影響。通過監(jiān)測電導(dǎo)率的變化可以了解溶液中無機(jī)鹽等雜質(zhì)的含量，通常，較高的電導(dǎo)率意味著有較多的無機(jī)鹽雜質(zhì)存在，這會(huì)影響葡萄糖晶體的純度。

5、所以，如何充分利用葡萄糖母液中各種小分子糖、提高葡萄糖母液綜合利用率與經(jīng)濟(jì)價(jià)值、提升葡萄糖結(jié)晶的純度和品質(zhì)是目前亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用葡萄糖二次母液制備葡萄糖結(jié)晶的方法，以枯草芽孢桿菌wb600作為底盤菌株，以pp43nmk作為表達(dá)載體，異源表達(dá)低聚糖脫支酶突變體，突變體為將seq?id?no.1所示氨基酸的第219位纈氨酸突變?yōu)楸彼幔玫桨獗磉_(dá)產(chǎn)物用于處理二次提取葡萄糖結(jié)晶后的殘留液體，經(jīng)過處理的葡萄糖二次母液中小分子糖的含量下降，葡萄糖的含量上升，用于再次結(jié)晶獲得一水葡萄糖。

2、本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種利用葡萄糖二次母液制備葡萄糖結(jié)晶的方法，使用低聚糖脫支酶突變體處理葡萄糖二次母液，所述葡萄糖二次母液為二次提取葡萄糖結(jié)晶后的殘留液體，所述低聚糖脫支酶突變體由seq?id?no.1所示氨基酸序列的第219位纈氨酸突變?yōu)楸彼岬玫?，由枯草芽孢桿菌異源表達(dá)。

3、進(jìn)一步地，還包括脫鹽、脫色、抽濾、濃縮、冷卻和干燥的步驟。

4、進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌以pp43nmk為表達(dá)載體。

5、進(jìn)一步地，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌wb600。

6、進(jìn)一步地，所述處理的時(shí)間為0-48小時(shí)。

7、優(yōu)選地，所述處理的時(shí)間為24小時(shí)。

8、進(jìn)一步地，所述葡萄糖二次母液的ph值為5-7。

9、優(yōu)選地，所述葡萄糖二次母液的ph值為6。

10、進(jìn)一步地，所述葡萄糖二次母液中底物的質(zhì)量濃度為10-50％。

11、優(yōu)選地，所述葡萄糖二次母液中底物的質(zhì)量濃度為40％。

12、進(jìn)一步地，所述低聚糖脫支酶突變體的添加量為0-50u/g。

13、優(yōu)選地，所述低聚糖脫支酶突變體的添加量為30u/g。

14、本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種重組枯草芽孢桿菌，所述重組枯草芽孢桿菌以枯草芽孢桿菌wb600為表達(dá)宿主，以pp43nmk為表達(dá)載體，異源表達(dá)低聚糖脫支酶突變體，所述低聚糖脫支酶突變體由seq?id?no.1所示氨基酸序列第219位纈氨酸突變?yōu)楸彼岬玫健?/p>

15、本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供包含上述重組枯草芽孢桿菌的微生物菌劑。

16、上述重組枯草芽孢桿菌或上述微生物菌劑在利用葡萄糖二次母液制備葡萄糖結(jié)晶中的應(yīng)用。

17、本發(fā)明的有益效果：

18、本發(fā)明通過基因工程的手段，將低聚糖脫支酶通過枯草芽孢桿菌系統(tǒng)進(jìn)行高效分泌表達(dá)，降低了獲取難度，簡化酶的提取流程，為低聚糖脫支酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。將低聚糖脫支酶突變體應(yīng)用于處理葡萄糖二次母液，并使用處理過的葡萄糖二次母液再次結(jié)晶獲得一水葡萄糖，產(chǎn)物脫色率和結(jié)晶率都得到提升，能夠有效解決現(xiàn)有技術(shù)中葡萄糖二次母液利用率低，市場價(jià)值受限的問題，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種利用葡萄糖二次母液制備葡萄糖結(jié)晶的方法，其特征在于：使用低聚糖脫支酶突變體處理葡萄糖二次母液，所述葡萄糖二次母液為二次提取葡萄糖結(jié)晶后的殘留液體，所述低聚糖脫支酶突變體由seq?id?no.1所示氨基酸序列的第219位纈氨酸突變?yōu)楸彼岬玫?，由枯草芽孢桿菌異源表達(dá)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌以pp43nmk為表達(dá)載體。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌wb600。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述處理的時(shí)間為0-48小時(shí)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖二次母液的ph值為5-7。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖二次母液中底物的質(zhì)量濃度為10-50％。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述低聚糖脫支酶突變體的添加量為0-50u/g。

8.一種重組枯草芽孢桿菌，其特征在于：所述重組枯草芽孢桿菌以枯草芽孢桿菌wb600為表達(dá)宿主，以pp43nmk為表達(dá)載體，異源表達(dá)低聚糖脫支酶突變體，所述低聚糖脫支酶突變體由seq?id?no.1所示氨基酸序列第219位纈氨酸突變?yōu)楸彼岬玫健?/p>

9.包含權(quán)利要求8所述重組枯草芽孢桿菌的微生物菌劑。

10.權(quán)利要求8所述的重組枯草芽孢桿菌或權(quán)利要求9所述的微生物菌劑在利用葡萄糖二次母液制備葡萄糖結(jié)晶中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種利用葡萄糖二次母液制備葡萄糖結(jié)晶的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以枯草芽孢桿菌WB600作為底盤菌株，以pP43NMK作為表達(dá)載體，異源表達(dá)低聚糖脫支酶突變體，突變體為將SEQ?ID?NO.1所示氨基酸的第219位纈氨酸突變?yōu)楸彼?，得到胞外表達(dá)產(chǎn)物用于處理二次提取葡萄糖結(jié)晶后的殘留液體，經(jīng)過處理的葡萄糖二次母液中小分子糖的含量下降，葡萄糖的含量上升，用于再次結(jié)晶獲得一水葡萄糖，產(chǎn)物脫色率和結(jié)晶率都得到提升，能夠有效解決現(xiàn)有技術(shù)中葡萄糖二次母液利用率低，市場價(jià)值受限的問題，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：李兆豐,孫昊,顧正彪,李才明,孔昊存
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30