本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種無細(xì)胞催化系統(tǒng)構(gòu)建優(yōu)化方法及其應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和鑒定一個群體感應(yīng)的信號分子外排泵；利用這個外排泵優(yōu)化基于群體感應(yīng)的微生物細(xì)胞自裂解系統(tǒng)，應(yīng)用于制備粗酶液進(jìn)一步用于生物催化和藥物投遞進(jìn)行治療。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞裂解物通常通過機(jī)械破碎(如高壓均質(zhì)和超聲波處理)或化學(xué)方法(如溶菌酶處理和化學(xué)溶劑提取)制備。生物學(xué)方法則包括在大腸桿菌中表達(dá)噬菌體λ內(nèi)溶素，但這需要額外步驟，如反復(fù)凍融或冷凍干燥以實現(xiàn)細(xì)胞裂解。相比之下，群體感應(yīng)(quorumsensing，qs)作為一種基于細(xì)胞密度的細(xì)菌通信過程，已被用于細(xì)胞自溶的研究。qs通過細(xì)菌產(chǎn)生的自誘導(dǎo)物來感知細(xì)胞密度的變化，從而協(xié)調(diào)基因表達(dá)和行為?；趒s的體系提供了一種更簡化的方法，省去了額外步驟，從而實現(xiàn)更高效的細(xì)胞自溶。這類系統(tǒng)已被開發(fā)用于在小鼠模型中控制細(xì)菌自溶以進(jìn)行藥物遞送。

2、自誘導(dǎo)物，如n-?；呓z氨酸內(nèi)酯(n-acyl-homoserine?lactones，hsls)，由大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的合成酶產(chǎn)生(大腸桿菌是醫(yī)學(xué)和工業(yè)中最廣泛使用的宿主)，并擴(kuò)散到周圍細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)菌群體達(dá)到一定的密度閾值時，自誘導(dǎo)物會激活響應(yīng)傳感器，表達(dá)噬菌體裂解基因(φx174e)，從而引發(fā)細(xì)胞自溶。然而，由于自誘導(dǎo)物的快速積累會導(dǎo)致在較低細(xì)胞密度(低于od600?0.2)時發(fā)生自溶，這限制了其在制備細(xì)胞裂解物方面的應(yīng)用。

3、為了解決上述問題，需要開發(fā)一種在較高細(xì)胞密度下實現(xiàn)程序化細(xì)胞自溶的方法，同時無需額外的機(jī)械或化學(xué)輔助。受到將細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)物泵出細(xì)胞的外排蛋白的啟發(fā)，我們推測某些外排蛋白可能有助于降低自誘導(dǎo)物的積累，從而優(yōu)化基于qs的自溶過程。。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提供了一種無細(xì)胞催化系統(tǒng)構(gòu)建優(yōu)化方法及其應(yīng)用，具體是一種基于群體感應(yīng)的外排泵輔助的自裂解無細(xì)胞系統(tǒng)的構(gòu)建方法。

2、利用細(xì)胞裂解物進(jìn)行無細(xì)胞生物催化，特別是使用大腸桿菌(e.coli)來源的裂解物，代表了一種變革性技術(shù)，但其全部潛力尚未完全發(fā)揮。目前亟需一種簡單易行的方法來制備細(xì)胞裂解物，例如在無需物理或化學(xué)輔助的情況下，實現(xiàn)高細(xì)胞密度下的程序化細(xì)胞自溶。盡管基于群體感應(yīng)(qs)的自溶系統(tǒng)已經(jīng)被開發(fā)，但這些系統(tǒng)通常在相對較低的細(xì)胞密度下運(yùn)行，使得細(xì)胞裂解物的制備變得復(fù)雜。為改進(jìn)基于qs的自溶系統(tǒng)，本發(fā)明測試了多種大腸桿菌外排泵，并確定其中一種能夠有效地排出qs自誘導(dǎo)物。一種可以外排群體感應(yīng)信號分子，比如ohc14-hsl(hydroxy-n-(tetrahydro-2-oxo-3-furanyl)tetradecanamide，ohc14)的外排泵蛋白acrab-tolc或者一個其對應(yīng)的蛋白mara可以通過調(diào)控acrab-tolc的表達(dá)水平進(jìn)而調(diào)控ohc14的外排。并利用其開發(fā)了群體感應(yīng)外排輔助自溶無細(xì)胞體系(quorum-sensing?exporter-assisted?autolysis?cell-free?systems，qe-acss)，使用acrab-tolc或mara均可以用于優(yōu)化基于群體感應(yīng)的自裂解無細(xì)胞系統(tǒng)。相應(yīng)的，與acrab-tolc相同的同屬于多藥外排泵的不同宿主來源的多藥外排泵均可以排出qs自誘導(dǎo)物。

3、本發(fā)明的目的可以通過以下方案來實現(xiàn)：

4、本發(fā)明提供了一種無細(xì)胞催化系統(tǒng)，包括如下基因元件：

5、用于排出信號分子的外排泵蛋白、合成群體感應(yīng)信號分子的合成酶、轉(zhuǎn)錄因子(tf)、信號分子響應(yīng)型啟動子、裂解功能蛋白。

6、所述無細(xì)胞催化系統(tǒng)中：

7、合成酶(cini)用于合成信號分子(ohc14)；外排泵蛋白(acrab-tolc)用于排出信號分子(ohc14)。

8、未被排出的信號分子(ohc14)被對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子(cinr)響應(yīng)，轉(zhuǎn)錄因子生成的受體蛋白結(jié)合未被排出的信號分子(ohc14)，再被信號分子響應(yīng)型啟動子(pcin)感應(yīng)并作用到信號分子響應(yīng)型啟動子，啟動并調(diào)控裂解功能蛋白，從而產(chǎn)生無細(xì)胞催化系統(tǒng)。

9、在此過程中，信號分子是在持續(xù)排出的，但細(xì)胞內(nèi)部的信號分子也會緩慢積累起來，待積累到一定閾值，就會激活功能蛋白。

10、本發(fā)明選用的外排泵，是針對長鏈信號分子的，可以特定排出這些信號分子，而不能排出短鏈的信號分子(如oc6)。而這些信號分子是可以作用于裂解功能蛋白的。本發(fā)明的外排泵和群體信號分子以及裂解功能蛋白的組合，是特殊的，其作為一個整體才能構(gòu)成本發(fā)明的無細(xì)胞催化系統(tǒng)，發(fā)揮作用。

11、作為本發(fā)明的一個實施方式，外排泵蛋白的外排能力通過以下方式的一種來提升：

12、(1)在無細(xì)胞催化系統(tǒng)中過表達(dá)外排泵蛋白；

13、(2)通過導(dǎo)入激活調(diào)控蛋白，來激活外排泵蛋白的表達(dá)。

14、所述激活調(diào)控蛋白為外排泵蛋白對應(yīng)的激活調(diào)控蛋白。優(yōu)選地，所述acrab-tolc的激活調(diào)控蛋白包括但不僅限于mara蛋白、soxs蛋白中的一種或多種。mara蛋白、soxs蛋白來源于大腸桿菌。mara蛋白、soxs蛋白作為表達(dá)激活轉(zhuǎn)錄因子，能增加acrab-tolc的表達(dá)，從而增加信號分子的外排。

15、所用mara的蛋白序列如seq?id?no.4所示。

16、當(dāng)細(xì)胞的od600超過一定數(shù)值時(根據(jù)功能蛋白的表達(dá)可以調(diào)整的)，達(dá)到閾值，開始裂解。泵的作用就是減少自裂解馬上啟動，達(dá)到優(yōu)化的效果。

17、作為本發(fā)明的一個實施方式，所述用于排出信號分子的外排泵蛋白包括acrab-tolc、adeabc、adefgh、adeijk、ttgabc、smeabc、smedef、smeyz、acrab、oqxab、mtrcde中的一種或多種。所用的外排泵蛋白可排出下述的信號分子。

18、優(yōu)選為外排泵蛋白acrab-tolc，包括三個蛋白acra、acrb、tolc。蛋白序列如下：

19、acra的蛋白序列如seq?id?no.1所示。

20、acrb的蛋白序列如seq?id?no.2所示。

21、tolc的蛋白序列如seq?id?no.3所示。

22、其中，

23、外排泵蛋白acrab-tolc來源于大腸桿菌或腸炎沙門菌；

24、外排泵蛋白adeabc、adefgh、adeijk來源于鮑氏不動桿菌acinetobacterbaumannii；

25、外排泵蛋白ttgabc來源于惡臭假單胞菌pseudomonasputida；

26、外排泵蛋白smeabc、smedef、smeyz來源于嗜麥芽狹長平胞菌stenotrophomonasmaltophilia；

27、外排泵蛋白acrab、oqxab來源于肺炎克雷伯菌klebsiella?pneumoniae；

28、外排泵蛋白mtrcde來源于淋病奈瑟球菌neisseria?gonorrhoeae。

29、作為本發(fā)明的一個實施方式，合成群體感應(yīng)信號分子的合成酶、轉(zhuǎn)錄因子及信號分子對應(yīng)如下中的一種：

30、合成酶cini，轉(zhuǎn)錄因子cinr，合成信號分子ohc14；

31、合成酶sini，轉(zhuǎn)錄因子sinr(sinorhizobiummeliloti)，信號分子3oc14(3-oxo-c14-hsl)；

32、合成酶vani，轉(zhuǎn)錄因子vanr(vibrio?anguillarum)，信號分子3oc10(3-oxo-c10-hsl)；

33、合成酶ceri，轉(zhuǎn)錄因子cerr(rhodobactersphaeroides)，信號分子7-cis-c14-hsl。

34、所述功能蛋白為用于群體感應(yīng)系統(tǒng)的裂解功能蛋白，對細(xì)胞進(jìn)行裂解。裂解功能蛋白包括但不僅限于裂解蛋白、內(nèi)溶素蛋白中的一種。本發(fā)明利用無細(xì)胞催化系統(tǒng)進(jìn)行高密度細(xì)胞的制備，實現(xiàn)功能蛋白的大量制備，后續(xù)應(yīng)用時發(fā)揮蛋白對應(yīng)的功能，比如裂解。裂解蛋白優(yōu)選為來源于噬菌體φx174的裂解基因e。內(nèi)溶素蛋白有多種來源，可約束為lamdaohage、t4?phage、t7?phage，同時可以增加colicin?m以及l(fā)amdaohage、t4phage、t7phage、phage?21這四個phage的holin蛋白。

35、作為本發(fā)明的一個實施方式，無細(xì)胞催化系統(tǒng)中的基因元件包括用于合成酶表達(dá)的啟動子。常用的普通的啟動子均可，如啟動子pj23可用于合成酶cini表達(dá)。

36、作為本發(fā)明的一個實施方式，信號分子響應(yīng)型啟動子為信號分子對應(yīng)的響應(yīng)型啟動子。如合成酶(cini)產(chǎn)生的信號分子ohc14，對應(yīng)的啟動子為pcin，ceri產(chǎn)生的信號分子激活的是pcer。

37、本發(fā)明的無細(xì)胞催化系統(tǒng)優(yōu)選為：用于排出信號分子的外排泵蛋白acrab-tolc、合成群體感應(yīng)信號分子的合成酶cini、轉(zhuǎn)錄因子cinr、信號分子響應(yīng)型啟動子pcin、功能蛋白裂解基因e(來源于噬菌體φx174)。

38、作為本發(fā)明的一個實施方式，無細(xì)胞催化系統(tǒng)中的基因元件包括感興趣的功能基因(goi)。感興趣的功能基因包括相應(yīng)功能的酶或待制備的蛋白。功能基因如rfp，可以根據(jù)需求被替換。

39、本發(fā)明提供了一種無細(xì)胞催化系統(tǒng)的構(gòu)建優(yōu)化方法，包括如下步驟：將無細(xì)胞催化系統(tǒng)中基因元件(合成群體感應(yīng)信號分子的合成酶、用于排出信號分子的外排泵蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、信號分子響應(yīng)型啟動子、功能蛋白等)，通過轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中；

40、或?qū)o細(xì)胞催化系統(tǒng)中除了用于排出信號分子的外排泵蛋白以外的基因元件(合成群體感應(yīng)信號分子的合成酶、轉(zhuǎn)錄因子、信號分子響應(yīng)型啟動子、功能蛋白等)，通過轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入到含有用于排出信號分子的外排泵蛋白的宿主細(xì)胞中。

41、構(gòu)建優(yōu)化方法中，可以根據(jù)需要的外排泵，選擇對應(yīng)的宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有該外排泵，可排出上述所有信號分子。宿主細(xì)胞如e.coli，含有外排泵蛋白acrab-tolc。

42、基因元件導(dǎo)入時，是單獨或組合導(dǎo)入質(zhì)粒或染色體上，進(jìn)一步導(dǎo)入到細(xì)胞宿主中。基因元件的相對位置和連接沒有要求。

43、作為本發(fā)明的一個實施方式，構(gòu)建優(yōu)化方法中，外排泵蛋白的外排能力通過以下方式的一種來提升：

44、(1)在無細(xì)胞催化系統(tǒng)中過表達(dá)外排泵蛋白；

45、(2)將激活調(diào)控蛋白與合成酶導(dǎo)入質(zhì)粒1，來激活外排泵蛋白的表達(dá)。

46、本發(fā)明提供了一種包含所述無細(xì)胞催化系統(tǒng)的工程菌。

47、所述菌株通過如下方法構(gòu)建得到的：

48、將無細(xì)胞催化系統(tǒng)中基因元件，通過轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入到細(xì)胞宿主中；

49、或?qū)o細(xì)胞催化系統(tǒng)中除了用于排出信號分子的外排泵蛋白的基因元件，通過轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入到含有用于排出信號分子的外排泵蛋白的細(xì)胞宿主中。

50、本發(fā)明還提供了一種所述無細(xì)胞催化系統(tǒng)在制備細(xì)胞裂解物中的應(yīng)用。無細(xì)胞催化系統(tǒng)所用的功能蛋白為裂解蛋白。

51、所述應(yīng)用為在無細(xì)胞催化系統(tǒng)中引入相應(yīng)的功能酶(感興趣的功能基因goi)進(jìn)行表達(dá)，制得含酶的細(xì)胞裂解物，制備的含功能酶的細(xì)胞裂解物用于生物合成或生物降解。

52、功能酶(感興趣的功能基因(goi))包括酚酸脫羧酶blpad、pet塑料降解酶petase中的一種，

53、具體為：

54、在無細(xì)胞催化系統(tǒng)中引入編碼blpad的基因，制備的細(xì)胞裂解物用于將p-ca轉(zhuǎn)化為4-乙烯基苯酚；

55、在無細(xì)胞催化系統(tǒng)中引入petase，制備的細(xì)胞裂解物用于pet的生物降解。

56、所述應(yīng)用為在無細(xì)胞催化系統(tǒng)中引入待制備的蛋白(感興趣的功能基因goi)，用于蛋白(無細(xì)胞)的生產(chǎn)。

57、本發(fā)明還提供了一種所述無細(xì)胞催化系統(tǒng)在治療輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用。所述應(yīng)用具體為：在無細(xì)胞催化系統(tǒng)中引入編碼抗腫瘤納米抗體的基因，注入到腫瘤時，細(xì)胞裂解，編碼抗腫瘤納米抗體的基因用于抑制腫瘤的生長?；虬╟d47nb納米抗體。

58、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

59、在本研究中，我們鑒定出一種自誘導(dǎo)物的外排蛋白，并利用其開發(fā)了群體感應(yīng)外排輔助自溶無細(xì)胞體系(quorum-sensing?exporter-assisted?autolysis?cell-freesystems，qe-acss)。我們首先在紅色熒光蛋白(red?fluorescence?protein，rfp)生產(chǎn)和小鼠模型的癌癥治療中測試了該體系。隨后，通過一個簡單的流程，包括生長、表達(dá)、收集、自溶和反應(yīng)(growth,expression,collection,autolysis,and?reaction，gecar)，我們將qe-acss與催化酶結(jié)合，成功應(yīng)用于利用來源于木質(zhì)素的原始對香豆酸(p-ca)進(jìn)行生物合成，以及對未經(jīng)處理的消費后pet(untreated?post-consumer，upc-pet)進(jìn)行生物降解。這兩種應(yīng)用均表現(xiàn)出較高的性能。