本發(fā)明涉及一種酶法磺酸化合成緩解潰瘍性結(jié)腸炎藥物硫酸膽固醇的方法，屬于生物。

背景技術(shù)：

1、潰瘍性結(jié)腸炎(uc)是炎癥性腸病最常見的形式之一，是一種慢性復(fù)發(fā)-緩解性炎癥性疾病，影響結(jié)腸，導(dǎo)致殘疾，需要終身治療。在過去的幾十年里，uc的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。uc患者表現(xiàn)為粘膜炎癥，始于直腸，并延伸至結(jié)腸近端。結(jié)腸上皮屏障缺陷與uc的發(fā)病機制密切相關(guān)。因此，治療uc的目的是誘導(dǎo)和維持緩解，包括臨床癥狀的緩解和內(nèi)窺鏡下的粘膜愈合。目前，uc的主要治療選擇是5-氨基水楊酸藥物、類固醇、免疫抑制劑和生物藥物。

2、硫酸膽固醇(cholesterol?sulfate,cs)是人體中重要的類固醇硫酸酯，由胞漿磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferase,sult)2b1催化合成，發(fā)揮多種重要的生理作用。其廣泛分布于人體，如皮膚、腎上腺、肝臟、肺、腦和子宮內(nèi)膜等。cs在表皮中參與角質(zhì)層角化套膜的形成和角質(zhì)細胞分化標(biāo)志物的表達，從而調(diào)節(jié)表皮脫屑和屏障功能；此外，cs還通過調(diào)節(jié)功能蛋白的活性參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。膳食補充膽固醇硫酸鹽可改善急性和慢性潰瘍性結(jié)腸炎。

3、酶法合成硫酸膽固醇以膽固醇和硫酸根為底物，經(jīng)過基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1催化合成膽固醇硫酸。

4、目前膽固醇硫酸鹽的合成方法多為化學(xué)合成，其制作工藝繁瑣，副產(chǎn)物多，導(dǎo)致無硫酸膽固醇類藥物應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種表達羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的重組菌，所述重組菌以大腸桿菌e.coli?bl21(de3)為宿主，表達來源于b.thetaiotaomicron的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1。

2、在一種實施方式中，所述的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的氨基酸序列如seq?idno.2所示。

3、在一種實施方式中，所述的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的核苷酸序列如seq?idno.1所示。

4、在一種實施方式中，以pet-28a(+)為表達載體。

5、本發(fā)明還提供構(gòu)建所述重組菌的方法，是將核苷酸序列為seq?id?no.1羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1基因連接到表達載體pet-28a(+)上，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌e.coli?bl21(de3)中，篩選正確的轉(zhuǎn)化子，即得重組大腸桿菌e.coli?bl21(de3)/pet-28a—sult2b1。

6、在一種實施方式中，所述羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的n端還添加了組氨酸標(biāo)簽。

7、本發(fā)明還提供了一種制備羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的方法，是將所述重組大腸桿菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用iptg誘導(dǎo)生產(chǎn)羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1。

8、在一種實施方式中，所述發(fā)酵具體為：

9、將所述重組大腸桿菌在帶有卡那霉素的lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37℃、220rpm培養(yǎng)6-8h制備種子液；

10、將所述種子液以10％的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37℃、220rpm培養(yǎng)至od達0.8-1.0后，用終濃度為0.5mm的iptg誘導(dǎo)，于30℃、220rpm繼續(xù)培養(yǎng)20h。

11、在一種實施方式中，所述方法還包括收集發(fā)酵液中的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1。

12、在一種實施方式中，所述方法還包括對所述羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1分離純化，具體步驟如下：離心發(fā)酵液，收集菌體，用磷酸緩沖液重懸后破壁，離心，收集上清液，上樣；使用ni柱，用磷酸鹽緩沖液平衡柱子10柱體積；采用咪唑梯度洗脫，咪唑用上述磷酸緩沖液配制，按照10mmol·l-1,40mmol·l-1，100mmol·l-1梯度洗脫。

13、本發(fā)明還提供一種高效合成膽固醇硫酸鹽的方法，所述方法是在含有硫酸根供體的反應(yīng)體系中，用所述羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1催化生產(chǎn)在反應(yīng)中可適當(dāng)添加。

14、在一種實施方式中，硫酸根供體是paps。

15、在一種實施方式中，反應(yīng)體系中緩沖溶液為10～50mm?tris-hcl，ph為7.5，添加50mm?atp，0.5～1.0mg/ml羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1。

16、在一種實施方式中，所述催化反應(yīng)溫度為30～35℃，催化時間≥4h。

17、在一種實施方式中，所述催化反應(yīng)溫度為35℃，催化時間為12h。

18、在一種實施方式中，催化體系添加有保護劑甘油、bsa、dtt中的一種或多種

19、在一種實施方式中，所述保護劑在反應(yīng)體系中的濃度≥10mg/ml。

20、本發(fā)明還提供了所述重組菌，或所述方法在制備硫酸膽固醇或含硫酸膽固醇的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

21、在一種實施方式中，所述產(chǎn)品包括但不限于緩解潰瘍性結(jié)腸炎的藥物。

22、本發(fā)明的有益效果：

23、(1)采用本發(fā)明的方法構(gòu)建的基因工程菌在大腸桿菌中進行表達，是一種快速生產(chǎn)羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的方法，采用鎳柱進行純化，方法簡單。

24、(2)大腸桿菌具有高表達水平，易于遺傳操作，培養(yǎng)條件簡單，成本低廉等優(yōu)點。

25、(3)大腸桿菌分泌表達的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1表達量高，酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，耐ph，溫度范圍廣。

26、(4)本發(fā)明通過向反應(yīng)體系中添加的穩(wěn)定劑和優(yōu)化催化體系可以使酶長時間保持較高的活性；

27、(5)本發(fā)明體外酶法高效合成膽固醇硫酸鹽，底物催化效率可達到62％，且純度較高，可以有效的進行膽固醇硫酸鹽的合成。

技術(shù)特征：

1.一種表達羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的重組菌，其特征在于，以大腸桿菌e.colibl21(de3)為宿主，表達來源于b.thetaiotaomicron的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1；所述的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組菌，其特征在于，以pet-28a(+)為表達載體，表達核苷酸序列如seq?id?no.1所示的基因。

3.一種制備羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1或2所述的重組菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并用iptg誘導(dǎo)制備羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法還包括收集發(fā)酵液中的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1；可選地，還包括對所述羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1分離純化。

5.一種合成硫酸膽固醇的方法，其特征在于，在含有硫酸根供體的反應(yīng)體系中，用seqid?no.2所示的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1催化反應(yīng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述硫酸根供體包括但不限于3’-磷酸腺苷-5’磷酸硫酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，反應(yīng)體系中含有20～80mm?atp，0.5～1。0mg/ml羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2b1。

8.根據(jù)權(quán)利要求5～7任一所述的方法，其特征在于，所述催化反應(yīng)的溫度為30～35℃，催化時間≥4h。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，催化體系含有保護劑；所述保護劑包括但不限于甘油、bsa、dtt中的一種或多種。

10.權(quán)利要求1或2所述的重組菌，或權(quán)利要求3～9任一所述方法在制備硫酸膽固醇或含硫酸膽固醇的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種酶法磺酸化合成緩解潰瘍性結(jié)腸炎藥物硫酸膽固醇的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌，對來自于B.thetaiotaomicron的羥基類固醇磺基轉(zhuǎn)移酶2B1進行表達后純化，再利用底物膽固醇在體外催化合成膽固醇硫酸鹽，實現(xiàn)膽固醇硫酸鹽的綠色、高效磺酸化修飾，從而用于緩解潰瘍性結(jié)腸炎藥物生產(chǎn)。

技術(shù)研發(fā)人員：康振,陳堅,胥睿睿,楊鳳玲,李瑀卓,李江華,堵國成
受保護的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2