本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程，具體涉及一種磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體及其制備方法和作為培養(yǎng)支架的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、帕金森病(parkinson's?disease，pd)是一種神經(jīng)退行性疾病，其特征包括中腦多巴胺能神經(jīng)元的缺失和路易小體的形成，小膠質(zhì)細(xì)胞在pd的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。正常情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞通過免疫監(jiān)控和清除碎片來維持神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定，但在pd中，其過度激活會導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，尤其是多巴胺能神經(jīng)元的損害，加劇疾病進(jìn)程(yildirim-balatanc,fenyia,besnaultp,et?al.parkinson’s?disease-derivedα-synuclein?assembliescombined?with?chronic-type?inflammatory?cues?promote?a?neurotoxic?microglialphenotype[j].journal?ofneuroinflammation,2024,21(1))。

2、由于腦內(nèi)生理環(huán)境復(fù)雜，研究小膠質(zhì)細(xì)胞在pd中的具體機(jī)制十分困難。因此，在體外構(gòu)建簡化的基質(zhì)環(huán)境以模擬和調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的行為，研究其與多巴胺能神經(jīng)元的互作，對于揭示pd的病理機(jī)制至關(guān)重要。近年來，具有微圖案和微形貌材料被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞行為(kim?m-j,lee?b,yang?k,et?al.bmp-2peptide-functionalizednanopatterned?substrates?for?enhanced?osteogenic?differentiation?of?humanmesenchymal?stem?cells[j].biomaterials,2013,34(30):7236-7246.)，但現(xiàn)有材料如pdms和pmma(yang?k,jung?h,lee?h-r,et?al.multiscale,hierarchically?patternedtopography?for?directing?human?neural?stem?cells?into?functional?neurons[j].acs?nano,2014,8(8):7809-7822.)雖然通過靜電紡絲的方法能生成納米纖維，但其在高度定向排列的有序性和操作工藝的簡便和重復(fù)性方面仍然存在問題，難以有效模擬pd的微環(huán)境，而且在靜電紡絲過程中，蛋白質(zhì)可能會經(jīng)歷拉伸、剪切和干燥等物理過程，這些都可能影響其結(jié)構(gòu)和活性，雖可通過優(yōu)化紡絲參數(shù)，如電壓、收集距離、溶液濃度和組成，在一定程度上控制纖維的形成過程，減少對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的不利影響，但是會進(jìn)一步增加制備和控制的復(fù)雜性，總體來看制備方法復(fù)雜，限定了其在體外研究和調(diào)控pd中小膠質(zhì)細(xì)胞行為中的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體及其制備方法和作為培養(yǎng)支架的應(yīng)用，本發(fā)明提供的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體能夠有效模擬pd的微環(huán)境，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞行為以及其與多巴胺能神經(jīng)元的互作，從而能作為研究和調(diào)控帕金森病中小膠質(zhì)細(xì)胞行為的培養(yǎng)支架，同時磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體制備方法簡單，具有柔性好、形貌規(guī)整、具有豐富的生物大分子活性位點和修飾可調(diào)控的特點。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體的制備方法，包括以下步驟：

4、將磁性納米顆粒、硅烷偶聯(lián)劑和溶劑混合，在堿性環(huán)境中進(jìn)行水解包被，得到氧化硅包被磁性微球；

5、將所述氧化硅包被磁性微球、生物大分子物質(zhì)和緩沖溶液混合進(jìn)行孵育，得到磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料溶液，所述生物大分子物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和/或胞外多糖，所述磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料溶液中含有磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料；

6、將所述磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料溶液在外加磁場中進(jìn)行磁吸，得到磁性顆粒-生物大分子復(fù)合預(yù)組裝體溶液；

7、將所述磁性顆粒-生物大分子復(fù)合預(yù)組裝體溶液和偶聯(lián)劑混合，得到混合體系；

8、將所述混合體系在外加磁場中于基底表面上進(jìn)行組裝，在基底表面得到磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體。

9、優(yōu)選的，所述磁性納米顆粒包括fe3o4納米顆粒、γ-fe2o3納米顆粒、cofe2o4納米顆粒和普魯士藍(lán)納米顆粒中的一種或多種；

10、所述磁性納米顆粒的粒徑為1～300nm；

11、所述硅烷偶聯(lián)劑包括正硅酸乙酯或者氨丙基三乙氧基硅烷。

12、優(yōu)選的，所述生物大分子物質(zhì)包括牛血清白蛋白、黃原膠、膠原蛋白和粘連蛋白中的一種或多種；

13、所述氧化硅包被磁性微球和所述生物大分子物質(zhì)的質(zhì)量比為1:(0.001～5)；

14、所述孵育的溫度為室溫，時間為20～30min。

15、優(yōu)選的，所述磁吸的時間為2～5min。

16、優(yōu)選的，所述偶聯(lián)劑包括第一偶聯(lián)劑或第二偶聯(lián)劑；所述第一偶聯(lián)劑為n-羥基丁二酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和2-嗎啉乙磺酸，所述n-羥基丁二酰亞胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和2-嗎啉乙磺酸的摩爾比為2:1:1；所述第二偶聯(lián)劑為戊二醛。

17、優(yōu)選的，所述組裝使用的外加磁場的磁場強度為0.1～1.5mt；所述組裝的溫度為35～37℃，時間為12～24h。

18、本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的制備方法制備得到的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體，所述磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體為組裝在所述基底表面由磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維空間排列形成的涂層結(jié)構(gòu)。

19、本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體作為培養(yǎng)支架的應(yīng)用。

20、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)支架用于體外研究神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的行為。

21、優(yōu)選的，所述神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞為與帕金森病有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，所述神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞包括小膠質(zhì)細(xì)胞(bv2細(xì)胞)和/或星形膠質(zhì)細(xì)胞；

22、所述應(yīng)用包括以下步驟：

23、將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述培養(yǎng)容器的基底表面組裝有上述技術(shù)方案所述的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體。

24、優(yōu)選的，所述細(xì)胞懸液包括小膠質(zhì)細(xì)胞和/或星形膠質(zhì)細(xì)胞；所述接種時細(xì)胞懸液中的細(xì)胞的接種量為30～40％。

25、本發(fā)明提供了一種磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體的制備方法，包括以下步驟：將磁性納米顆粒、硅烷偶聯(lián)劑和溶劑混合，在堿性環(huán)境中進(jìn)行水解包被，得到氧化硅包被磁性微球；將所述氧化硅包被磁性微球與生物大分子物質(zhì)和緩沖溶液混合進(jìn)行孵育，得到磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料溶液，所述生物大分子物質(zhì)包括蛋白質(zhì)和/或胞外多糖，所述磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料溶液中含有磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料；將所述磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料溶液在外加磁場中進(jìn)行磁吸，得到磁性顆粒-生物大分子復(fù)合預(yù)組裝體溶液；將所述磁性顆粒-生物大分子復(fù)合預(yù)組裝體溶液和偶聯(lián)劑混合，得到混合體系；將所述混合體系在外加磁場中于基底表面上進(jìn)行組裝，在基底表面得到磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體。本發(fā)明使用氧化硅包被磁性微球作為內(nèi)核，通過三部組裝法，首先在氧化硅包被磁性微球表面均勻包裹一層生物大分子物質(zhì)；然后在第一次的外加磁場作用下，磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料溶液中磁性顆粒-生物大分子復(fù)合材料進(jìn)行預(yù)組裝，得到磁性顆粒-生物大分子復(fù)合預(yù)組裝體的溶液；最后通過添加偶聯(lián)劑實現(xiàn)磁性顆粒-生物大分子復(fù)合預(yù)組裝體與基底表面的偶聯(lián)反應(yīng)，同時在第二次外加磁場的作用下，在基底表面磁性顆粒-生物大分子復(fù)合預(yù)組裝體進(jìn)行組裝，形成空間排列均勻的單層磁性復(fù)合纖維(即磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維)，在基底表面形成有機(jī)纖維微圖案(涂層)，同時通過偶聯(lián)劑誘導(dǎo)的偶聯(lián)反應(yīng)，能夠增強單層磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維與基底表面的結(jié)合力。因此，本發(fā)明通過外部磁場的變化，在基底表面生成不同規(guī)格的纖維形貌形成組裝體(涂層結(jié)構(gòu))，制備方法簡單，重復(fù)性高。本發(fā)明制備的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體可在體外實現(xiàn)對細(xì)胞的行為學(xué)調(diào)控，模擬小膠質(zhì)細(xì)胞與多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的互作。本發(fā)明制備的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體作為培養(yǎng)支架具備以下特性：本發(fā)明制備的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體在水、pbs緩沖液及細(xì)胞培養(yǎng)基中的良好的穩(wěn)定性；本發(fā)明制備的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體具有強各向異性和生物活性信號，可以介入細(xì)胞行為的調(diào)控。由實施例的結(jié)果表明，本發(fā)明制備的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體作為體外培養(yǎng)支架處理的與pd相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞(實施例中為bv2)吞噬能力增強且不被過度激活，不僅能夠揭示調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞行為的潛在機(jī)制，而且能夠研究小膠質(zhì)細(xì)胞與多巴胺能神經(jīng)元互作，為pd微環(huán)境提供了體外模型，對開發(fā)針對pd的小膠質(zhì)細(xì)胞治療策略具有重要意義。

26、本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的制備方法制備得到的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體，所述磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體為組裝在所述基底表面由磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維空間排列形成的涂層結(jié)構(gòu)，所述磁性復(fù)合纖維具有各向異性和生物活性信號。本發(fā)明提供的磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體作為培養(yǎng)支架，對bv2小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力進(jìn)行了處理和分析，rna-seq技術(shù)分析顯示，經(jīng)過磁性顆粒-生物大分子復(fù)合纖維組裝體作為培養(yǎng)支架培養(yǎng)的bv2細(xì)胞表現(xiàn)出增強的吞噬能力，部分炎癥因子下調(diào)，與凋亡和細(xì)胞粘附相關(guān)的基因表達(dá)水平下調(diào)，而泛素介導(dǎo)的蛋白水解相關(guān)基因表達(dá)水平上調(diào)，細(xì)胞骨架也發(fā)生了變化。