本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域技術(shù)，尤其是指一種從外周血單個核細(xì)胞重編程獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、如何建立高質(zhì)量的多能干細(xì)胞一直是干細(xì)胞研究的核心問題，2017年鄧宏魁研究組發(fā)現(xiàn)了一種名為lcdm的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基可以培養(yǎng)小鼠和人類的傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞(escs)，并將多能干細(xì)胞(pscs)誘導(dǎo)到一種不同的多能性狀態(tài)，命名為“擴(kuò)展多能性”(yanget?al.，2017b)。擴(kuò)展性多能干細(xì)胞(epscs)表現(xiàn)出突出的發(fā)育潛力和雙向嵌合能力，有助于胚胎組織和胚胎外組織發(fā)育，包括卵黃囊和胎盤。該研究組利用eps細(xì)胞建立了快速制備基因修飾動物模型的技術(shù)(li?et?al.,2019a)，并利用人eps細(xì)胞高效制備功能性肝細(xì)胞(eps-heps)(wang?et?al.,2020)，與傳統(tǒng)人多能干細(xì)胞制備的肝細(xì)胞相比，eps-heps在轉(zhuǎn)錄譜上更接近于人原代肝細(xì)胞。該研究結(jié)果揭示了由eps細(xì)胞制備功能性細(xì)胞的應(yīng)用潛力，可以為體外制備功能細(xì)胞提供更好的來源。

2、國際其他研究組也在eps細(xì)胞的研究和應(yīng)用中取得了一系列重要進(jìn)展，利用eps細(xì)胞在體外構(gòu)建功能性的早期胚胎結(jié)構(gòu)(li?et?al.,2019b；sozen?et?al.,2019)；將人eps細(xì)胞注射到食蟹猴早期囊胚中，制備了人猴嵌合體胚胎，并成功使胚胎存活時間達(dá)到20天，這是目前猴子胚胎體外培養(yǎng)能達(dá)到的最大時長(tan?et?al.,2021)。這些研究都表明eps細(xì)胞具有廣泛的應(yīng)用前景和優(yōu)勢。epsc相比于ipsc具有分化形成的功能細(xì)胞更接近體細(xì)胞(chen，2020)、體外進(jìn)行基因編輯效率更高(xiang，2019)和傳代過程中基因組更穩(wěn)定等優(yōu)勢(liu，2021)(zheng，2021)。epsc已成功分化為很多細(xì)胞類型，包括體細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞，這極大助力了再生醫(yī)學(xué)的研究例如疾病建模、療法篩選、毒性測試、遺傳疾病研究和生殖生物學(xué)研究，epsc已經(jīng)成為多能干細(xì)胞研發(fā)重要細(xì)胞來源。

3、目前普遍獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的方法是先通過重編程的方式獲得誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或直接采用胚胎干細(xì)胞在lcdm小分子的作用下誘導(dǎo)成擴(kuò)展性多能干細(xì)胞，該方式誘導(dǎo)周期長，效率低，成本高；因此，針對此現(xiàn)狀，迫切需要開發(fā)于一種從外周血單個核細(xì)胞重編程獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的方法，以滿足實際需要。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在之缺失，其主要目的是提供一種從外周血單個核細(xì)胞重編程獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的方法，其通過質(zhì)粒電轉(zhuǎn)的方式對pbmc細(xì)胞直接進(jìn)行重編程操作，進(jìn)而獲得epsc克隆，縮短了重編程周期，提高了效率；該重編程方法與現(xiàn)有的先建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞再采用lcdm四因子誘導(dǎo)下獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞方法相比，明顯縮短獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的時間，且誘導(dǎo)效率更高，操作簡單，且無病毒載體引入，具有良好的應(yīng)用前景。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下之技術(shù)方案：

3、一種從外周血單個核細(xì)胞重編程獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的方法，包括如下步驟：

4、外周血單個核細(xì)胞(pbmc)經(jīng)過三個階段的重編程獲取擴(kuò)展性多能干細(xì)胞(epsc)；該三個階段的重編程具體步驟包括：

5、s1、外周血單個核細(xì)胞擴(kuò)增階段；

6、s2、質(zhì)粒電轉(zhuǎn)階段；

7、s3、含lcdm四因子培養(yǎng)基誘導(dǎo)階段。

8、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s3中含lcdm四因子培養(yǎng)基誘導(dǎo)階段具體為：在電轉(zhuǎn)后第一天，更換培養(yǎng)基i；電轉(zhuǎn)后第三天更換培養(yǎng)基ii，電轉(zhuǎn)后第五天更換培養(yǎng)基ⅲ，每天換液，至eps克隆出現(xiàn)。

9、作為一種優(yōu)選方案：所述培養(yǎng)基i包括stemspantm?sfemⅱ和stemspantm?cd34+expansion?supplement(10x)；所述培養(yǎng)基ii包括stemspantm?sfemⅱ；所述培養(yǎng)基ⅲ包括knock-out?dmem/f-12、neurobasal、neaa、knock-out血清替代物、b-27、n-2、(s)-(+)-dimethindene?maleate、recombinant?human?lif、2-mercaptoethanol、minocyclinehydrochloride、iwr-1-endo、chir99021、y-27632、glutamax?supplement、gsk126。

10、作為一種優(yōu)選方案：所述培養(yǎng)基ⅲ包括體積百分比為45％的knock-out?dmem/f-12、體積百分比為45％的neurobasal、體積百分比為1％的neaa、體積百分比為為5％的knock-out血清替代物、體積百分比為1％的b-27、體積百分比為0.5％的n-2、濃度為2μm的(s)-(+)-dimethindene?maleate、濃度為10ng/ml的recombinant?human?lif、濃度為0.1mm的2-mercaptoethanol、濃度為2μm的minocycline?hydrochloride、濃度為1μm的iwr-1-endo、濃度為1μm的chir99021、濃度為2μm的y-27632、濃度為1％的glutamax?supplement、濃度為1μm的gsk126。

11、作為一種優(yōu)選方案：所述重編程包含一個或多個載體，所述一個或多個載體是質(zhì)粒；所述步驟s2中質(zhì)粒電轉(zhuǎn)階段是將質(zhì)粒通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入pbmc細(xì)胞，培養(yǎng)通過電轉(zhuǎn)導(dǎo)入質(zhì)粒后的pbmc細(xì)胞直至出現(xiàn)eps克隆；所述質(zhì)粒包括pcxle-hsk，pcxle-hul，pcxle-hoct3/4，pcxwb-ebna1任意三種或三種以上的組合。

12、作為一種優(yōu)選方案：所述質(zhì)粒pcxle-hsk，pcxle-hul，pcxle-hoct3/4，pcxwb-ebna1的用量均設(shè)置在5μg/2.0×106細(xì)胞。

13、作為一種優(yōu)選方案：所述步驟s1中外周血單個核細(xì)胞pbmc的獲取方法為：將pbmc培養(yǎng)，計數(shù)，離心，并用dpbs清洗，棄上清，通過培養(yǎng)基i對pbmc進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

14、作為一種優(yōu)選方案：所述外周血單個核細(xì)胞(pbmc)的初始細(xì)胞量在5×104-2×106cells。

15、作為一種優(yōu)選方案：所述pbmc擴(kuò)增后通過電轉(zhuǎn)的方式將質(zhì)粒以其dna的形式，或者以其mrna的形式導(dǎo)入pbmc中。

16、作為一種優(yōu)選方案：所述質(zhì)粒導(dǎo)入pbmc的形式包括仙臺病毒轉(zhuǎn)染體系、mrna轉(zhuǎn)染體系和附加體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染形式。

17、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點和有益效果，具體而言，由上述技術(shù)方案可知：

18、第一、通過質(zhì)粒電轉(zhuǎn)的方式對pbmc細(xì)胞直接進(jìn)行重編程操作，進(jìn)而獲得epsc克隆，縮短了重編程周期，提高了效率。

19、第二、用較少的pbmc細(xì)胞量即抽取少量的血即可獲得更高的epsc細(xì)胞株，減少了獲取成本。

20、第三、該重編程方法與現(xiàn)有的先建立誘導(dǎo)多能干細(xì)胞再采用lcdm四因子誘導(dǎo)下獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞方法相比，明顯縮短獲得擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的時間，且誘導(dǎo)效率更高，操作簡單，且無病毒載體引入，具有良好的應(yīng)用前景。

21、第四、在四個小分子：recombinant?human?lif、chir99021、(s)-(+)-dimethindene?maleate和min-c(minocycline,hydrochloride)(lcdm)作用下，能夠顯著提高重編程效率，實現(xiàn)高效制備擴(kuò)展性多能干細(xì)胞。

22、第五、本發(fā)明通過提供一種新的更便捷的方式將體細(xì)胞重編程為擴(kuò)展性多能干細(xì)胞，完善了體細(xì)胞重編程為擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的途徑，提高了重編程效率和擴(kuò)展性多能干細(xì)胞的純度，解決了現(xiàn)有技術(shù)中誘導(dǎo)效率低以及使用病毒載體可能引入潛在安全風(fēng)險的問題。

23、為更清楚地闡述本發(fā)明的結(jié)構(gòu)特征和功效，下面結(jié)合附圖與具體實施例來對其進(jìn)行詳細(xì)說明。