發(fā)明領域本技術涉及適合促進人肌營養(yǎng)不良蛋白基因的外顯子跳躍的新反義化合物和組合物。還提供了使用適合用于本發(fā)明方法的反義組合物誘導外顯子跳躍的方法。

背景技術：

0、發(fā)明背景

1、使用多種化學制劑在不同水平上(轉錄、剪接、穩(wěn)定性、翻譯)影響基因表達，發(fā)展了反義技術。這類研究中有許多在指征的寬泛范圍內專注于使用反義化合物校正或補償異?；蚣膊∠嚓P基因。反義分子能夠特異性地抑制基因表達，因此，許多研究，其致力于作為基因表達調節(jié)劑的寡核苷酸，已關注于抑制靶向基因(targeted?gene)的表達或順式作用元件的功能。在一些病毒rna靶標的情況下，反義寡核苷酸通常針對rna，或正義鏈(如mrna)或是負鏈。為了實現特定基因減量調節(jié)的期望效果，寡核苷酸通常促進靶向mrna的降解，阻斷mrna的翻譯或阻斷順式作用rna元件的功能，由此有效地防止靶蛋白的從頭合成或病毒rna的復制。

2、然而，如果目的是上調天然蛋白的產生或補償誘導翻譯的提前終止的突變，例如無義或移碼突變，則這些技術不起作用。在這些情況中，缺陷型基因轉錄物不會進行靶向降解(targeted?degration)或空間抑制，所以反義寡核苷酸化學制劑不會促進靶mrna降解或阻斷翻譯。

3、在許多遺傳疾病中，突變對基因最終表達的影響可通過剪接過程中靶向外顯子跳躍的過程進行調節(jié)。該剪接過程受復雜多成分機制的指導，該機制使mrna前體(pre-mrna)中的相鄰外顯子-內含子連接緊密相連并切割內含子末端的磷酸二酯鍵，伴隨著它們在要剪接在一起的外顯子之間的后續(xù)改造。這個復雜且高度精確過程是通過mrna前體中的序列基元介導的，所述序列基元是相對半保守的rna片段，參與之后剪接反應的許多核剪接因子都與其結合。通過改變剪接機制讀取或識別參與mrna前體加工的基元的方式，可以產生差異化的剪接mrna分子。現在已認識到大部分人基因在正?；虮磉_過程中可選地剪接，盡管仍未鑒定出相關機制。

4、在正常功能蛋白因突變而提前終止的情況中，通過反義技術恢復一些功能蛋白產生的方式已經表明，在剪接過程通過干擾是可能的，并且如果與致病突變相關的外顯子可被從一些基因中特異性地缺失，則有時會產生縮短的蛋白產物，其具有與天然蛋白相似的生物特性或具有足以改善由與外顯子相關的突變導致的疾病的生物活性(sierakowska,sambade?et?al.1996；wilton,lloyd?et?al.1999；van?deutekom,bremmer-bout?etal.2001；lu,mann?et?al.2003；aartsma-rus,janson?et?al.2004)。kole等(美國專利第5,627,274號、第5,916,808號、第5,976,879號以及第5,665,593號)公開了使用不會促進靶向mrna前體降解的修飾的反義寡核苷酸類似物與異常剪接斗爭的方法。bennett等(美國專利第6,210,892號)描述了野生型細胞mrna加工的反義調控也使用不會誘導rnase?h-介導的靶rna切割的反義寡核苷酸類似物。

5、靶向外顯子跳躍的過程可能特別可用于長基因，在所述長基因中，有許多外顯子和內含子，有多余的外顯子的基因組成或蛋白無需一個或多個特定外顯子就能夠發(fā)揮功能。使基因加工重定向用于治療與各種基因中的突變所導致的截短相關的遺傳疾病的努力，致力于使用以下反義寡核苷酸：其(1)與參與剪接過程的元件完全或部分重疊；或(2)在足夠接近元件位置上與mrna前體結合以阻止正常介導在該元件中發(fā)生的特定剪接反應的剪接因子的結合和功能。

6、杜興肌營養(yǎng)不良(duchenne?muscular?dystrophy,dmd)是由于肌營養(yǎng)不良蛋白表達上的缺陷導致的。編碼該蛋白的基因含有遍布于超過2百萬個核苷酸的dna中的79個外顯子。任何外顯子突變，會改變外顯子讀碼框(reading?frame)，或引入終止密碼子，或特征在于去除完整的框外外顯子或多個外顯子或一個或多個外顯子的副本，因此都可有潛力干擾功能性肌營養(yǎng)不良蛋白的產生，從而導致dmd。

7、肌營養(yǎng)不良不太嚴重的形式是貝克肌營養(yǎng)不良(becker?muscular?dystrophy,bmd)，據發(fā)現，其發(fā)生的原因在于，突變通常是一個或多個外顯子的缺失導致沿著整個肌營養(yǎng)不良蛋白轉錄物的正確讀碼框，使得mrna翻譯為蛋白不會提前終止。如果在突變的肌營養(yǎng)不良蛋白mrna前體加工中，上游和下游外顯子的連接保持了基因的正確讀碼框，則結果是編碼具有短的內部缺失的蛋白的mrna，所述蛋白保留了導致貝克表型的一些活性。

8、一個外顯子或多個外顯子的缺失不會改變肌營養(yǎng)不良蛋白的讀碼框，但會引起bmd表型，而導致移碼的外顯子缺失將引起dmd(monaco,bertelson?et?al.1988)。通常，肌營養(yǎng)不良蛋白突變包括改變讀碼框從而阻斷正常蛋白翻譯的點突變和外顯子缺失，因而導致dmd。還應該指出，一些bmd和dmd患者具有覆蓋多個外顯子的外顯子缺失。

9、盡管反義分子可以為治療杜興肌營養(yǎng)不良(dmd)提供工具，使用反義分子誘導外顯子跳躍的嘗試成效不一。使用定向于外顯子內的側翼接剪接位點或基元的多種反義分子成功實現了肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子19從肌營養(yǎng)不良蛋白mrna前體的跳躍，所述外顯子包含在如errington等(errington,mann?et?al.2003)所述的外顯子定義中。

10、wilton等(wilton,lloyd?et?al.1999)首次報道了在mdx小鼠模型中特異性的可重復的外顯子跳躍的實例。通過使反義分子定向于供體剪接位點，在將培養(yǎng)的細胞處理6小時之內，在肌營養(yǎng)不良蛋白mrna中誘導了外顯子23跳躍。wilton等還描述了用更長的反義寡核苷酸靶向小鼠肌營養(yǎng)不良蛋白mrna前體的受體區(qū)域。盡管定向于內含子23供體剪接位點的第一反義寡核苷酸誘導了原代培養(yǎng)的成肌細胞(primary?cultured?myoblast)中的外顯子跳躍，但是發(fā)現該化合物在表達更高水平的肌營養(yǎng)不良蛋白的永生細胞培養(yǎng)物中效力低得多。

11、盡管有這些努力，仍需要用于dmd治療應用的靶向多個肌營養(yǎng)不良蛋白外顯子的改善的反義寡聚體和改善的肌送遞組合物和方法。

技術實現思路

0、發(fā)明概述

1、本發(fā)明的實施方案通常涉及能夠結合選定的靶標以誘導外顯子跳躍的反義化合物，和使用所述反義化合物誘導外顯子跳躍的方法。在某些實施方案中，可以將本發(fā)明的兩個或多個反義寡核苷酸組合在一起，來誘導單個或多個外顯子跳躍。

2、在某些實施方案中，可以通過將兩個或多個反義寡核苷酸分子共價連接在一起，改善單個或多個外顯子的外顯子跳躍(參見例如aartsma-rus,janson?et?al.2004)。

3、在某些實施方案中，本發(fā)明的反義化合物誘導了人肌營養(yǎng)不良蛋白基因中的外顯子跳躍，由此使得肌肉細胞產生功能性肌營養(yǎng)不良蛋白。

4、本發(fā)明的反義寡核苷酸化合物(在本文中也稱為寡聚體)通常：(i)包含嗎啉代亞基和將一個亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接的含磷亞基間連接，(ii)含有10-40個堿基，優(yōu)選20-35個堿基，(iii)包含可有效地與肌營養(yǎng)不良蛋白mrna前體中靶序列的至少12個連續(xù)堿基交雜并誘導外顯子跳躍的堿基序列。

5、在某些實施方案中，根據下述結構(i)，本發(fā)明的反義化合物可包含含磷亞基間連接，所述連接將一個亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接：

6、

7、其中：

8、y1是-o-、-s-、-nh-或-ch2-；

9、z是o或s；

10、pj是通過堿基特異性氫鍵合有效地與多核苷酸堿基結合的嘌呤或嘧啶堿基對部分；和

11、x是氟，任選地取代的烷基，任選地取代的烷氧基，任選地取代的硫代烷氧基，氨基，任選地取代的烷氨基，或任選地取代的雜環(huán)基。

12、在某些實施方案中，不帶電的上述亞基間連接可以散布著在生理ph中帶正電荷的連接，其中正電荷的連接的總數在2和不大于連接總數一半之間。例如，帶正電荷的連接可具有上述結構，其中x是任選地取代的1-哌嗪基。在其他實施方案中，帶正電荷連接可具有上述結構，其中x是取代的1-哌嗪基，其中1-哌嗪基是在4位上被任選地取代的烷基胍基部分取代。

13、如果給予的反義化合物可有效地靶向預加工的人肌營養(yǎng)不良蛋白的剪接位點，則它可具有與含有預加工的信使rna(mrna)人肌營養(yǎng)不良蛋白轉錄物中的至少12個連續(xù)堿基的靶區(qū)域互補的堿基序列。示例性反義序列包括seq?id?nos:1-569和612-633所確定的那些序列。

14、在某些實施方案中，本發(fā)明的反義序列包含于：

15、(a)seq?id?nos:1-20,優(yōu)選地seq?id?nos:4、8、11和12，和更優(yōu)選地seq?id?no:12所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子44跳躍；

16、(b)seq?id?nos:21-76和612-624,優(yōu)選地seq?id?nos:27、29、34和39，和更優(yōu)選地seq?id?no:34所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子45跳躍；

17、(c)seq?id?nos:77-125,優(yōu)選地seq?id?nos:21-53，和更優(yōu)選地seq?id?no:82、84-87、90、96、98、99和101所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子46跳躍；

18、(d)seq?id?nos:126-169,優(yōu)選地seq?id?nos:126-149，和更優(yōu)選地seq?id?no:126、128-130、132、144和146-149所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子47跳躍；

19、(e)seq?id?nos:170-224和634,優(yōu)選地seq?id?nos:170-201和634，和更優(yōu)選地seq?id?no:176、178、181-183、194和198-201所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子48跳躍；

20、(f)seq?id?nos:225-266,優(yōu)選地seq?id?nos:225-248，和更優(yōu)選地seq?id?no:227、229、234、236、237和244-248所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子49跳躍；

21、(g)seq?id?nos:267-308,優(yōu)選地seq?id?nos:277、287和290，和更優(yōu)選地seq?idno:287所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子50跳躍；

22、(h)seq?id?nos:309-371,優(yōu)選地seq?id?nos:324、326和327，和更優(yōu)選地seq?idno:327所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子51跳躍；

23、(i)seq?id?nos:372-415,優(yōu)選地seq?id?nos:372-397，和更優(yōu)選地seq?id?no:379-382、384、390和392-395所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子52跳躍；

24、(j)seq?id?nos:416-475和625-633,優(yōu)選地seq?id?nos:428、429和431，和更優(yōu)選地seq?id?no:429所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子53跳躍；

25、(k)seq?id?nos:476-519,優(yōu)選地seq?id?nos:476-499，和更優(yōu)選地seq?id?no:479-482、484、489和491-493所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子54跳躍；

26、(l)seq?id?nos:520-569和635,優(yōu)選地seq?id?nos:520-546和635，和更優(yōu)選地seq?id?no:524-528、537、539、540、542和544所確定的任何序列，用于在人肌營養(yǎng)不良蛋白預加工的mrna的加工中產生外顯子55跳躍；

27、在某些實施方案中，化合物可與能有效促進細胞吸收化合物的富含精氨酸的多肽偶聯。示例性肽，除了本文所述的其他肽外，還包括seq?id?nos:570-578所確定的肽。

28、在一個示例性實施方案中，富含精氨酸的多肽在其n末端或c末端殘基與反義化合物的3’或5’端共價偶聯。還在示例性實施方案中，反義化合物由嗎啉代亞基和將一個亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接的含磷亞基間連接組成。

29、通常，肽-寡聚體偶聯物還可包含對選定的哺乳動物組織即與細胞穿透肽所靶向的相同組織具有選擇性的導向肽(homing?peptide)。該偶聯物可以是以下形式：細胞穿透肽-導向肽-反義寡聚體，或更優(yōu)選以下形式：導向肽-細胞穿透肽-反義寡寡聚體。例如如上所述用于治療杜興肌營養(yǎng)不良的肽偶聯化合物還可包含對肌肉組織具有選擇性的導向肽，例如具有seq?id?no:579所確定的序列的肽，其與細胞穿透肽偶聯。這種類型的示例性偶聯物包括本文中表示為cp06062-msp-pmo(細胞穿透肽-導向肽-反義寡聚體)和表示為msp-cp06062-pmo(導向肽-細胞穿透肽-反義寡聚體)(參見seq?id?nos:580-583)的那些偶聯物。

30、在一些實施方案中，肽通過連接體部分與寡聚體偶聯。在某些實施方案中，連接體部分可包含任選地取代的哌嗪部分。在其他實施方案中，連接體部分還可包含β丙氨酸和/或6-氨基己酸亞基。仍然在其他實施方案中，肽直接與寡聚體偶聯，而無需連接體部分。

31、肽與寡聚體的偶聯可以位于任何適合在肽和寡聚體之間或在連接體部分和寡聚體之間形成共價鍵的位置。例如，在一些實施方案中，肽的偶聯可以位于寡聚體的3’端。在其他實施方案中，肽與寡聚體的偶聯可以位于寡聚體的5’端。仍然在其他實施方案中，肽可以通過任何亞基間連接與寡聚體偶聯。

32、在一些實施方案中，肽在寡聚體的5’端與寡聚體偶聯。在包含含磷亞基間連接的實施方案中，肽可以通過與末端連接基團的磷的共價鍵與寡聚體偶聯。這種方式的偶聯可能需要或不需要上述連接體部分。

33、仍然在其他實施方案中，肽在寡聚體的3’端與寡聚體偶聯。在一些其他實施方案中，肽與寡聚體3’末端嗎啉代基團的氮原子偶聯。在這方面，肽可以直接或通過上述連接體部分與寡聚體偶聯。

34、在一些實施方案中，寡聚體可以與能增強寡聚體在水性介質中溶解度的部分偶聯。在一些實施方案中，能增強寡聚體在水性介質中溶解度的部分是聚乙二醇。仍然在其他實施方案中，能增強寡聚體在水性介質中溶解度的部分是三乙二醇(triethyleneglycol)。例如，在一些實施方案中，能增強在水性介質中溶解度的部分可以在寡聚體的5’端與寡聚體偶聯。能增強寡聚體在水性介質中溶解度的部分與寡聚體的偶聯可以是直接的或通過上述連接體部分。

35、本發(fā)明的某些實施方案提供了選定和/或適合輔助遺傳疾病的預防性治療或治療性治療的反義分子，其包含至少一個具有適合送遞至患者形式的反義分子。

36、本發(fā)明的某些實施方案提供了治療患有遺傳疾病的患者的方法，其中，在編碼特定蛋白的基因中存在突變且突變的影響可通過外顯子跳躍消除，其包括以下步驟：(a)按照本文所述方法選擇反義分子；和(b)將分子給予需要這種治療的患者。本發(fā)明也包括純化和分離的本發(fā)明反義寡核苷酸在制備用于治療遺傳疾病的藥物中的用途。

37、某些實施方案提供了治療肌營養(yǎng)不良例如特征為杜興肌營養(yǎng)不良的疾病狀況的方法，該方法包括給予需要治療的患者有效量的如本文所述的適當設計的反義寡核苷酸，該反義寡核苷酸與該患者中的具體基因病變相關。而且，某些實施方案提供了預防性治療患者以便預防或至少最小化包括杜興肌營養(yǎng)不良在內的肌營養(yǎng)不良的方法，其包括以下步驟：給予患者有效量的反義寡核苷酸或包含一種或多種這些生物分子的藥物組合物。

38、某些實施方案涉及治療個體的肌營養(yǎng)不良的方法，其包括給予患者有效量的基本不帶電的反義化合物，該反義化合物含有20-35個通過含磷亞基間連接而連接的嗎啉代亞基，該連接將一個亞基的嗎啉代氮與相鄰亞基的5’環(huán)外碳連接，該反義化合物包含選自seqid?nos:1-569和612-635且能夠與肌營養(yǎng)不良蛋白基因外顯子中的互補mrna序列在所述化合物和mrna之間形成tm為至少45℃的異源雙鏈體的序列，其中該外顯子選自外顯子44-55。

39、在某些實施方案中，肌營養(yǎng)不良是杜興肌營養(yǎng)不良(dmd)。在某些實施方案中，肌營養(yǎng)不良是貝克肌營養(yǎng)不良(bmd)。

40、在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:1-20，且外顯子是外顯子44。在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:21-76和612-624，且外顯子是外顯子45。

41、在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:77-125，且外顯子是外顯子46。在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:126-169，且外顯子是外顯子47。

42、在某些實施方案中，序列選自下組seq?id?nos:170-224和634，且外顯子是外顯子48。在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:225-266，且外顯子是外顯子49。

43、在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:267-308，且外顯子是外顯子50。在某些實施方案中，序列選自下組seq?id?nos:309-371，且外顯子是外顯子51。

44、在某些實施方案中，序列選自下組seq?id?nos:372-415，且外顯子是外顯子52。在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:416-475和625-633，且外顯子是外顯子53。在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:476-519，且外顯子是外顯子54。在某些實施方案中，序列選自seq?id?nos:520-569和635，且外顯子是外顯子55。在某些實施方案中，序列包含seqid?nos:287或基本上由其組成。

45、某些實施方案提供了治療遺傳疾病的試劑盒，該試劑盒包含被包裝在適宜容器中的至少一種本發(fā)明的反義寡核苷酸，及其使用說明。

46、結合附圖閱讀以下本發(fā)明的詳細說明將會更深入地理解這些和其他目的和特征。