本文件涉及用于真核細(xì)胞中基因組工程化的方法和材料，且尤其涉及通過共同遞送一種或多種化學(xué)物質(zhì)(諸如表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)、植物激素和/或再生加強(qiáng)基因)與基因組工程化組分來提高基因組工程化(即，轉(zhuǎn)化或基因組編輯)效率的方法。

背景技術(shù)：

0、發(fā)明背景

1、傳統(tǒng)育種已產(chǎn)生馴養(yǎng)的植物和動物，而現(xiàn)代生物技術(shù)(尤其是基因組工程化)正在擴(kuò)大育種能力，并實(shí)現(xiàn)僅單獨(dú)用傳統(tǒng)近緣種(close?species)的雜交無法實(shí)現(xiàn)的改善。利用生物技術(shù)，已將諸如高產(chǎn)、除草劑耐受性和昆蟲抗性的多種性狀導(dǎo)入作物，其顯著地增進(jìn)全球農(nóng)業(yè)和糧食安全。但是，由于產(chǎn)品中存在外來dna，生物技術(shù)已引發(fā)生物安全和環(huán)境問題。

2、通過分離出整合的dna，基因組編輯技術(shù)可用于生成靶基因組的位點(diǎn)特異性修飾，而在最終植物中不存在外來dna。此外，通過瞬時(shí)表達(dá)，基因組編輯僅涉及瞬時(shí)編輯活性，以產(chǎn)生位點(diǎn)特異性修飾，而在過程的任何點(diǎn)沒有dna整合?；蚪M編輯的植物，特別是源自瞬時(shí)活性的那些，與常規(guī)的基因組修飾的植物有顯著地不同，并且可能不會作為經(jīng)遺傳修飾的(gm)植物受到監(jiān)管。基因組編輯技術(shù)(特別通過瞬時(shí)編輯方法)在農(nóng)業(yè)中提供高度準(zhǔn)確、安全和強(qiáng)大的植物育種和開發(fā)工具。

3、然而，基于瞬時(shí)活性的基因組工程化面臨更多挑戰(zhàn)。與穩(wěn)定轉(zhuǎn)化相比，瞬時(shí)工程化通常會導(dǎo)致更少的修飾的細(xì)胞并且在沒有整合的可選擇標(biāo)志物時(shí)，鑒定工程化的細(xì)胞并在再生的植物中實(shí)現(xiàn)同質(zhì)(homogenous)修飾是高度挑戰(zhàn)的。這些挑戰(zhàn)阻礙瞬時(shí)基因編輯作為改良植物的育種工具的常規(guī)實(shí)施。因此，非常需要增強(qiáng)基因組工程化效率的新方法和材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在本發(fā)明中令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞中的基因組工程化效率可以通過將基因組工程化組分與第二化合物共同遞送到細(xì)胞中而提高，所述第二化合物選自表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)例如蛋白質(zhì)脫乙?；敢种苿┗騞na甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，特別是組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci，例如曲古抑菌素(trichostatin)a(tsa))，植物激素(例如生長素、細(xì)胞分裂素)和/或引起從體細(xì)胞組織、愈傷組織或胚性組織中植物再生得到改善的蛋白質(zhì)。另外，促進(jìn)化學(xué)物質(zhì)與基因組工程化組分的共同遞送提供生長益處(特別是為轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)，并因此用作對于回收轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的積極選擇策略。

2、因此，本發(fā)明的第一方面是用于在植物細(xì)胞中的遺傳修飾的方法，其包含

3、(a)將以下共同導(dǎo)入植物細(xì)胞

4、(i)基因組工程化組分和

5、(ii)第二化合物，其包含

6、(ii.1)表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)或其活性衍生物，特別是dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或蛋白質(zhì)脫乙?；敢种苿瑑?yōu)選組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci)，和/或

7、(ii.2)植物激素或其活性衍生物，和/或

8、(ii.3)引起從體細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞或胚性細(xì)胞的植物再生得以改善的蛋白質(zhì)或包含編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)盒，和

9、(b)在允許在存在第二化合物時(shí)通過基因組工程化組分的活性來遺傳修飾所述植物細(xì)胞的基因組的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞，

10、優(yōu)選地，其中基因組工程化組分(i)和/或第二化合物(ii)在植物細(xì)胞中是瞬時(shí)有活性的和/或是瞬時(shí)存在的。

11、已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，所有三種類型的化合物(ii.1)，(ii.2)和(ii.3)均獨(dú)立地能夠提高受基因組工程化組分(i)影響的植物細(xì)胞遺傳修飾的效率。化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)可以單獨(dú)使用或以兩種或更多種化合物或化合物類型的組合使用，例如類型(ii.1)的兩種或更多種化合物或類型(ii.1)的一種化合物和類型(ii.2)的一種化合物等等。當(dāng)提及所有三種化合物類型(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)時(shí)，同義地使用術(shù)語“化合物(ii)”。

12、在植物細(xì)胞中遺傳修飾的方法可以包含另一個(gè)步驟c)，其獲得和/或選擇經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或植物或其部分，所述植物或其部分包含經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞或衍生自經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞，并且在至少一個(gè)細(xì)胞中包含基因組的遺傳修飾。選擇可以通過檢測遺傳修飾的手段來進(jìn)行例如通過基于pcr方法的手段，或通過表型特征的手段例如除草劑抗性、顏色或熒光標(biāo)志物、形態(tài)特征如株高等等。這種表型特征可以由外源(標(biāo)志物)基因賦予，所述外源(標(biāo)志物)基因穩(wěn)定地整合到植物細(xì)胞的基因組中。

13、在一個(gè)特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，上述方法不包含基于穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞基因組中的外源選擇性標(biāo)志物基因的選擇過程。

14、在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，共同導(dǎo)入引起從體細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞或胚性細(xì)胞的植物再生得以改善的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)或包含編碼所述一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)盒?！耙粋€(gè)或多個(gè)”可以是至少一個(gè)，至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、或者可以是一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多個(gè)。優(yōu)選地，所述一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)相對于改善的植物再生具有累加作用或甚至協(xié)同作用。

15、適宜的植物細(xì)胞

16、用于本發(fā)明的植物細(xì)胞可以是任何類型的植物材料的部分或衍生自任何類型的植物材料，優(yōu)選地為芽、下胚軸、子葉、莖、葉、葉柄、根、胚、愈傷組織、花、配子體或其部分。可以使用分離的植物細(xì)胞以及植物材料，即含有植物細(xì)胞的整個(gè)植物或植物的部分。

17、植物的一部分或多個(gè)部分可以與整個(gè)完整的植物附著或分開。這樣的植物部分包括但不限于植物的器官、組織和細(xì)胞，及優(yōu)選地為種子。

18、本發(fā)明適用于任何植物物種，無論是單子葉植物還是雙子葉植物。優(yōu)選地，可以經(jīng)受本發(fā)明的方法和用途的植物是選自以下屬的植物：大麥屬(hordeum)、高粱屬(sorghum)、甘蔗屬(saccharum)、玉蜀黍?qū)?zea)、狗尾草屬(setaria)、稻屬(oryza)、小麥屬(triticum)、黑麥屬(secale)、黑小麥屬(triticale)、蘋果屬(malus)、短柄草屬(brachypodium)、山羊草屬(aegilops)、胡蘿卜屬(daucus)、甜菜屬(beta)、桉屬(eucalyptus)、煙草屬(nicotiana)、茄屬(solanum)、咖啡屬(coffea)、葡萄屬(vitis)、erythrante、螺旋貍藻屬(genlisea)、黃瓜屬(cucumis)、marus、擬南芥屬(arabidopsis)、須彌芥屬(crucihimalaya)、碎米薺屬(cardamine)、獨(dú)行菜屬(lepidium)、薺屬(capsella)、olmarabidopsis、筷子芥屬(arabis)、蕓苔屬(brassica)、芝麻菜屬(eruca)、蘿卜屬(raphanus)、柑橘屬(citrus)、麻風(fēng)樹屬(jatropha)、楊屬(populus)、苜蓿屬(medicago)、鷹咀豆屬(cicer)、木豆屬(cajanus)、菜豆屬(phaseolus)、大豆屬(glycine)、棉屬(gossypium)、黃芪屬(astragalus)、蓮屬(lotus)、蝴蝶草屬(torenia)、蔥屬(allium)或向日葵屬(helianthus)。更優(yōu)選地，植物是選自以下種的植物：大麥(hordeum?vulgare)、球莖大麥(hordeum?bulbusom)、兩色高粱(sorghum?bicolor)、甘蔗(saccharumofficinarium)、包括玉米(zea?mays)的玉蜀黍?qū)傥锓N(zea?spp.)、小米(setariaitalica)、小粒稻(oryza?minuta)、水稻(oryza?sativa)、澳洲野生稻(oryzaaustraliensis)、高稈野生稻(oryza?alta)、小麥(triticum?aestivum)、硬粒小麥(triticum?durum)、黑麥(secale?cereale)、黑小麥(triticale)、蘋果(malusdomestica)、二穗短柄草(brachypodium?distachyon)、海濱大麥(hordeum?marinum)、節(jié)節(jié)麥(aegilops?tauschii)、daucus?glochidiatus、包括甜菜(beta?vulgaris)的甜菜屬物種(beta?spp.)、小胡蘿卜(daucus?pusillus)、daucus?muricatus、胡蘿卜(daucus?carota)、巨桉(eucalyptus?grandis)、美花煙草(nicotiana?sylvestris)、絨毛狀煙草(nicotianatomentosiformis)、普通煙草(nicotiana?tabacum)、本氏煙草(nicotiana?benthamiana)、番茄(solanum?lycopersicum)、馬鈴薯(solanum?tuberosum)、中果咖啡(coffeacanephora)、葡萄(vitis?vinifera)、erythrante?guttata、螺旋貍藻(genlisea?aurea)、黃瓜(cucumis?sativus)、marus?notabilis、arabidopsis?arenosa、深山南芥(arabidopsis?lyrata)、擬南芥(arabidopsis?thaliana)、喜馬拉雅鼠耳芥(crucihimalaya?himalaica)、卵葉須彌芥(crucihimalaya?wallichii)、彎曲碎米薺(cardamine?nexuosa)、北美獨(dú)行菜(lepidium?virginicum)、薺菜(capsella?bursapastoris)、olmarabidopsis?pumila、硬毛南芥(arabis?hirsute)、歐洲油菜(brassicanapus)、甘藍(lán)(brassica?oleracea)、蕪菁(brassica?rapa)、蘿卜(raphanus?sativus)、芥菜(brassica?juncacea)、黑芥(brassica?nigra)、芝麻菜(eruca?vesicariasubsp.sativa)、甜橙(citrus?sinensis)、麻風(fēng)樹(jatropha?curcas)、毛果楊(populustrichocarpa)、蒺藜狀苜蓿(medicago?truncatula)、山下鷹嘴豆(cicer?yamashitae)、cicer?bijugum、鷹嘴豆(cicer?arietinum)、網(wǎng)狀鷹嘴豆(cicer?reticulatum)、cicerjudaicum、木豆(cajanus?cajanifolius)、蔓草蟲豆(cajanus?scarabaeoides)、菜豆(phaseolus?vulgaris)、大豆(glycine?max)、棉花(gossypium?sp.)、紫云英(astragalussinicus)、百脈根(lotus?japonicas)、夏堇(torenia?fournieri)、洋蔥(allium?cepa)、蔥(allium?fistulosum)、蒜(allium?sativum)、向日葵(helianthus?annuus)、菊芋(helianthus?tuberosus)和/或韭菜(allium?tuberosum)。特別優(yōu)選地是甜菜(betavulgaris)、玉米(zea?mays)、小麥(triticum?aestivum)、大麥(hordeum?vulgare)、黑麥(secale?cereale)、向日葵(helianthus?annuus)、馬鈴薯(solanum?tuberosum)、兩色高粱(sorghum?bicolor)、蕪菁(brassica?rapa)、歐洲油菜(brassica?napus)、芥菜(brassicajuncacea)、甘藍(lán)(brassica?oleracea)、蘿卜(raphanus?sativus)、水稻(oryza?sativa)、大豆(glycine?max)和/或棉花(gossypium?sp.)。

19、基因組工程化組分

20、本文所用的術(shù)語“基因組工程化”是指在植物中遺傳修飾的方法學(xué)，即用于修飾植物的基因組的方法學(xué)。優(yōu)選地，術(shù)語是指a)植物或植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，優(yōu)選為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化以及b)植物或植物細(xì)胞的基因組編輯?；蚪M工程化可以在分離的植物細(xì)胞或植物組織中進(jìn)行，優(yōu)選在細(xì)胞培養(yǎng)物中或在完整的植物(intact?plants)中進(jìn)行，即它可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行。

21、基因組工程化組分可以以蛋白質(zhì)和/或編碼基因組工程化組分的核酸特別是以dna諸如質(zhì)粒dna、rna、mrna或rnp導(dǎo)入。

22、基因組工程化可用于制備轉(zhuǎn)基因植物材料。根據(jù)本文公開內(nèi)容使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的(transgenic)”是指包含基因或遺傳構(gòu)建體的植物、植物細(xì)胞、組織、器官或材料，其包含自另一生物體通過自然手段或通過轉(zhuǎn)化技術(shù)的手段已轉(zhuǎn)移至植物、植物細(xì)胞、組織器官或材料中的“轉(zhuǎn)基因”。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”包含核酸序列(包括dna或rna)或氨基酸序列，或其組合或混合。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”不限于通常被識別為“基因”的序列，即編碼蛋白質(zhì)的序列。它也可以指，例如，非編碼蛋白質(zhì)的dna或rna序列。因此，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”通常意味著相應(yīng)的核酸或氨基酸序列不是天然存在于相應(yīng)的靶細(xì)胞(包括植物、植物細(xì)胞、組織、器官或材料)的。因此，本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”或“轉(zhuǎn)基因的”是指這樣的核酸序列或氨基酸序列，其從一個(gè)生物體的基因組獲得或合成產(chǎn)生，并然后通過分子生物學(xué)，遺傳學(xué)等人工技術(shù)其以瞬時(shí)或穩(wěn)定方式導(dǎo)入另一個(gè)生物體。如本文所用，“植物材料”是指可以在任何發(fā)育階段期間從植物獲得的任何材料。植物材料可以以植物原位(in?planta)獲得或從植物或其植物組織或器官的體外培養(yǎng)物中獲得。因此，術(shù)語包含植物細(xì)胞、組織和器官以及發(fā)育的植物結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞組分，如核酸、多肽以及可以在植物細(xì)胞或區(qū)室內(nèi)找到和/或可以由植物產(chǎn)生或可以從處于任何發(fā)育階段的任何植物細(xì)胞、組織或植物的提取物中獲得的所有化學(xué)植物物質(zhì)或代謝物。術(shù)語還包含植物材料的衍生物(例如原生質(zhì)體)，其衍生自植物材料所包含的至少一個(gè)植物細(xì)胞。因此，術(shù)語還包含植物的分生組織細(xì)胞或分生組織。

23、對于待修飾的植物細(xì)胞，盡管基于生物學(xué)方法的轉(zhuǎn)化方法，諸如農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化或病毒載體介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化和基于物理遞送方法的轉(zhuǎn)化方法，如粒子轟擊或顯微注射已發(fā)展成為將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入感興趣的植物細(xì)胞或組織的突出技術(shù)。helenius等人，(“genedelivery?into?intact?plants?using?the?heliostm?gene?gun”，plant?molecularbiology?reporter,2000,18(3):287-288)公開了一種粒子轟擊作為將材料導(dǎo)入植物細(xì)胞的物理方法。目前，因此存在多種植物轉(zhuǎn)化方法以將遺傳構(gòu)建體形式的遺傳物質(zhì)導(dǎo)入感興趣的植物細(xì)胞，包含植物生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以用于將編碼至少一個(gè)與壁相關(guān)的激酶的至少一個(gè)基因?qū)胫参锛?xì)胞、組織、器官或完整植物中至少一個(gè)的至少一個(gè)細(xì)胞中的生物和物理手段。值得注意的是，所述用于轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的遞送方法可同時(shí)應(yīng)用于導(dǎo)入本發(fā)明的工具。一種常見的生物學(xué)手段是用農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化，其幾十年來已用于各種不同的植物材料。病毒載體介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化代表將遺傳物質(zhì)導(dǎo)入感興趣的細(xì)胞的另一種策略。在植物生物學(xué)中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用的物理手段是粒子轟擊，也稱為基因槍轉(zhuǎn)染(biolistictransfection)或微粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，是指將包含感興趣的核酸或遺傳構(gòu)建體的包被的微?；蚣{米顆粒轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞或組織中的物理遞送方法。物理導(dǎo)入手段適合于導(dǎo)入核酸，即rna和/或dna以及蛋白質(zhì)。同樣，存在用于將感興趣的核酸或氨基酸構(gòu)建體特異性地導(dǎo)入植物細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染方法，包括電穿孔、顯微注射、納米顆粒和細(xì)胞穿透肽(cpp)。此外，存在基于化學(xué)的轉(zhuǎn)染方法以導(dǎo)入遺傳構(gòu)建體和/或核酸和/或蛋白質(zhì)，尤其包含用磷酸鈣轉(zhuǎn)染、使用脂質(zhì)體(例如陽離子脂質(zhì)體)轉(zhuǎn)染或使用陽離子聚合物(包括dead-右旋糖酐或聚乙烯亞胺)轉(zhuǎn)染或其組合。單獨(dú)或組合的以上遞送技術(shù)可用于體內(nèi)(包括植物原位)或體外方法。

24、如本文所用，術(shù)語“基因組編輯”是指用于植物細(xì)胞的任何遺傳信息或基因組的靶向、特異性修飾的策略和技術(shù)。因此，這些術(shù)語既包含基因編輯，也包含除基因組的基因編碼區(qū)域以外的區(qū)域的編輯，例如內(nèi)含子序列、非編碼rna、mirna、調(diào)節(jié)元件序列(如啟動子、終止子、轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)合位點(diǎn)、順式或反式作用元件)。額外地，術(shù)語可以包含針對單個(gè)核堿基的靶向取代的堿基編輯。它可以進(jìn)一步包含植物細(xì)胞的核基因組以及其他遺傳信息(即線粒體基因組或葉綠體基因組以及mirna、前體mrna或mrna)的編輯。此外，“基因組編輯”可以包含可能導(dǎo)致基因表達(dá)中的可遺傳改變的表觀遺傳編輯或工程化，即靶向修飾，例如dna甲基化或組蛋白修飾(諸如組蛋白乙?；⒔M蛋白甲基化、組蛋白泛素化、組蛋白磷酸化、組蛋白sumo化、組蛋白核糖基化或組蛋白瓜氨酸化)的靶向修飾。

25、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所述基因組工程化組分包含

26、a)雙鏈dna斷裂(dsb)誘導(dǎo)酶或編碼其的核酸，其優(yōu)選地識別所述細(xì)胞的基因組中的預(yù)定位點(diǎn)，以及任選地包含修復(fù)核酸分子，或

27、b)單鏈dna或rna斷裂(ssb)誘導(dǎo)酶或編碼其的核酸，其優(yōu)選識別所述細(xì)胞的基因組中的預(yù)定位點(diǎn)，以及任選地包含修復(fù)核酸分子，或

28、c)堿基編輯器酶，任選地與解除武裝的dsb誘導(dǎo)酶或ssb誘導(dǎo)酶融合，其優(yōu)選地識別所述細(xì)胞的基因組中的預(yù)定位點(diǎn)，或

29、d)影響dna甲基化、組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、組蛋白泛素化，組蛋白磷酸化、組氨酸sumo化、組蛋白核糖基化或組蛋白瓜氨酸化的酶，其優(yōu)選地與解除武裝的dsb誘導(dǎo)酶或ssb誘導(dǎo)酶融合，其優(yōu)選地識別所述細(xì)胞的基因組中的預(yù)定位點(diǎn)。

30、如本文所用，“雙鏈dna斷裂誘導(dǎo)酶”或“dsbi酶”是能夠在特定核苷酸序列(被稱為“識別位點(diǎn)”或“預(yù)定位點(diǎn)”)上誘導(dǎo)雙鏈dna斷裂的酶。因此，“單鏈dna或rna斷裂誘導(dǎo)酶”或“ssbi酶”是能夠在特定核苷酸序列(被稱為“識別位點(diǎn)”或“預(yù)定位點(diǎn)”)上誘導(dǎo)單鏈dna或rna斷裂的酶。

31、為了能有在預(yù)定的靶位點(diǎn)的斷裂，酶優(yōu)選包括結(jié)合/識別結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域。能夠誘導(dǎo)雙鏈或單鏈斷裂的特定酶是核酸酶或切口酶及其變體，包括不再包含核酸酶或切口酶功能而是作為識別分子與另一種酶組合起作用的分子。近年來，已經(jīng)開發(fā)了許多合適的核酸酶，特別是定制的內(nèi)切核酸酶，其包含大范圍核酸酶、鋅指核酸酶、tale核酸酶、argonaute核酸酶(其衍生自例如利用格氏嗜鹽堿桿菌(natronobacterium?gregoryi))和crispr核酸酶(包含例如作為成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)(crispr)系統(tǒng)的部分的cas9、cpf1、casx或casy核酸酶)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方面，基因組工程化組分包含dsb或ssb誘導(dǎo)酶或其變體，其選自crispr/cas內(nèi)切核酸酶，優(yōu)選地為crispr/cas9內(nèi)切核酸酶或crispr/cpf1內(nèi)切核酸酶，鋅指核酸酶(zfn)，歸巢內(nèi)切核酸酶，大范圍核酸酶和tal效應(yīng)物核酸酶。

32、稀有切割(rare-cleaving)內(nèi)切核酸酶是具有優(yōu)選為約14至70個(gè)連續(xù)的核苷酸的識別位點(diǎn)的dsbi/ssbi酶，并因此即使在較大基因組(諸如大多數(shù)植物基因組)中，具有非常低的切割頻率。歸巢內(nèi)切核酸酶，也稱為大范圍核酸酶，構(gòu)成此類稀有切割內(nèi)切核酸酶的家族。它們可由內(nèi)含子、獨(dú)立基因或間插序列(intervening?sequence)編碼，并呈現(xiàn)出驚人的結(jié)構(gòu)和功能特性，使它們與更經(jīng)典的限制性酶區(qū)分開，通常與細(xì)菌限制性修飾ii型系統(tǒng)區(qū)分開。它們的識別位點(diǎn)具有一般的不對稱性，這與大多數(shù)限制性酶識別位點(diǎn)的特征性二重對稱性(characteristic?dyad?symmetry)相反。由內(nèi)含子或內(nèi)含肽編碼的幾種歸巢內(nèi)切核酸酶已顯示促進(jìn)其各自的遺傳元件向等位基因無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽位點(diǎn)歸巢。通過在無內(nèi)含子或無內(nèi)含肽等位基因中進(jìn)行位點(diǎn)特異性雙鏈斷裂，這些核酸酶產(chǎn)生重組發(fā)生末端，所述重組發(fā)生末端參與基因轉(zhuǎn)變過程，所述過程復(fù)制編碼序列，并導(dǎo)致在dna水平插入內(nèi)含子或間插序列。在wo03/004659的表i(第17至20頁)(其通過引用并入本文)中提供其他稀有切割大范圍核酸酶及其各自的識別位點(diǎn)的列表。

33、此外，存在設(shè)計(jì)基本上識別所選的任何靶核苷酸序列的定制的稀有切割內(nèi)切核酸酶的方法。簡而言之，可以利用設(shè)計(jì)為識別特異性核苷酸序列的鋅指結(jié)構(gòu)域和諸如fokl的來自天然限制性酶的非特異性dna切割結(jié)構(gòu)域之間的雜合體來制備嵌合限制性酶。此類方法在例如以下中進(jìn)行描述：wo03/080809，wo94/18313或wo95/09233以及isalan等，(2001)，a?rapid,generally?applicable?method?to?engineer?zinc?fingers?illustrated?bytargeting?the?hiv-1promoter.nature?biotechnology,19(7):656；liu等，(1997)，design?of?polydactyl?zinc-finger?proteins?for?unique?addressing?withincomplex?genomes，proceedings?of?the?national?academy?of?sciences，94(11):5525-5530.)。

34、專門設(shè)計(jì)的內(nèi)切核酸酶的另一個(gè)示例包括tale核酸酶(talen)，其基于融合到核酸酶的催化結(jié)構(gòu)域(例如，foki或其變體)的來自黃單胞菌(xanthomonas)細(xì)菌屬的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(tale)。這些tale的dna結(jié)合特異性由串聯(lián)排列的34/35個(gè)氨基酸重復(fù)單元的重復(fù)可變二殘基(rvd)定義，使得一個(gè)rvd特異性地識別靶dna中的一個(gè)核苷酸。可以組裝重復(fù)單元以基本上識別任何靶序列，并且可以將重復(fù)單元與核酸酶的催化結(jié)構(gòu)域融合以產(chǎn)生序列特異性內(nèi)切核酸酶(參見例如，boch等，(2009)，breaking?the?code?of?dnabinding?specificity?of?tal-type?iii?effectors，science，326(5959)，509-1512；moscou&bogdanove(2009)。a?simple?cipher?governs?dna?recognition?by?taleffectors，science，326(5959)，1501-1501；以及wo2010/079430、wo2011/072246、wo2011/154393、wo2011/146121、wo2012/001527、wo2012/093833、wo2012/104729、wo2012/138927、wo2012/138939)。wo2012/138927還描述單體(緊湊型)talen和具有各種催化結(jié)構(gòu)域的tale及其組合。

35、最近，已經(jīng)描述了一種新型的可定制內(nèi)切核酸酶系統(tǒng)；即所謂的crispr/cas系統(tǒng)。在其自然環(huán)境中的crispr系統(tǒng)描述了一種分子復(fù)合物，其包含至少一個(gè)與可產(chǎn)生特異性dna雙鏈斷裂的cas核酸酶或另一種crispr核酸酶如cpf1核酸酶(zetsche等，“cpf1is?asingle?rna-guides?endonuclease?of?a?class?2crispr-cas?system”,cell,163,pp.1-13,october?2015)組合的小的且單獨(dú)的非編碼rna。目前，crispr系統(tǒng)分為兩類，包括五種類型的crispr系統(tǒng)，例如用cas9作為效應(yīng)物的ii型系統(tǒng)，以及用cpf1作為效應(yīng)物分子的v型系統(tǒng)(makarova等，nature?rev.microbiol.，2015)。在人工crispr系統(tǒng)中，可以將合成的非編碼rna和crispr核酸酶和/或任選地修飾的crispr核酸酶(經(jīng)修飾作為切口酶或缺乏任何核酸酶功能而作用)與至少一種組合crrna和/或tracrrna的功能的合成或人工向?qū)na或grna組合使用(makarova等，2015，同上)。在天然系統(tǒng)中crispr/cas介導(dǎo)的免疫應(yīng)答需要crispr-rna(crrna)，其中控制crispr核酸酶特異性激活的該向?qū)na的成熟在迄今為止已表征的多種crispr系統(tǒng)之間存在顯著差異。首先，將入侵dna(也稱為間隔區(qū))整合到crispr基因座近端的兩個(gè)相鄰重復(fù)區(qū)域之間。ii型crispr系統(tǒng)將cas9核酸酶編碼為干擾步驟的關(guān)鍵酶，該系統(tǒng)既包含crrna，且又包含反式激活rna(tracrrna)作為向?qū)Щ?。這些雜交并形成雙鏈(ds)rna區(qū)域，其被rnaseiii識別并可以被切割以形成成熟的crrna。然后，這些反過來又與cas分子締合，以便將核酸酶特異性地引導(dǎo)至靶核酸區(qū)域。重組grna分子既可包含可變dna識別區(qū)域，且也可包含cas相互作用區(qū)域，并因此可以獨(dú)立于特異性靶核酸和期望的cas核酸酶而被專門設(shè)計(jì)。作為另一種安全機(jī)制，pam(與前間隔區(qū)域鄰近基序)必須存在于靶核酸區(qū)域中；這些是與來自cas9/rna復(fù)合物識別的dna直接相連的dna序列。針對來自釀膿鏈球菌(streptococcus?pyogenes)的cas9的pam序列已被描述為“ngg”或“nag”(標(biāo)準(zhǔn)iupac核苷酸代碼)(jinek等，“a?programmabledual-rna-guided?dna?endonuclease?inadaptive?bacterial?immunity”，science?2012，337：816-821)。針對來自金黃色葡萄球菌(staphylococcus?aureus)的cas9的pam序列是“nngrrt”或“nngrr(n)”。其他變體crispr/cas9系統(tǒng)是已知的。因此，腦膜炎奈瑟氏菌(neisseria?meningitidis)cas9在pam序列nnnngatt處切割。嗜熱鏈球菌(streptococcus?thermophilus)cas9在pam序列nnagaaw處切割。最近，已經(jīng)描述了用于彎曲桿菌(campylobacter)的crispr系統(tǒng)的另一種pam基序nnnnryac(wo2016/021973a1)。對于cpf1核酸酶，已經(jīng)描述了與通常由cas9系統(tǒng)識別的富g的pam相反，沒有tracrrna的cpf1-crrna復(fù)合物經(jīng)由短的富t的pam進(jìn)行的有效地識別和切割靶dna(zetsche等，同上)。此外，通過使用修飾的crispr多肽，可以獲得特異性單鏈斷裂。cas切口酶與各種重組grna的組合使用還可通過雙dna切口的方式誘導(dǎo)高度特異性dna雙鏈斷裂。此外，通過使用兩個(gè)grna，可以優(yōu)化dna結(jié)合的特異性，并因而可以優(yōu)化dna切割。同時(shí)，其他最初針對細(xì)菌描述的crispr效應(yīng)物，如casx和casy效應(yīng)物是可得到的并且代表其他效應(yīng)物，其可用于基因組工程化目的(burstein等，“new?crispr-cas?systems?fromuncultivated?microbes”，nature，2017，542，237-241)。

36、dsbi/ssbi酶的切割位點(diǎn)與dna或rna上誘導(dǎo)斷裂的確切位置有關(guān)。切割位點(diǎn)可包含或可不包含在dsbi/ssbi酶的識別位點(diǎn)中(可與dsbi/ssbi酶的識別位點(diǎn)重疊或可不與dsbi/ssbi酶的識別位點(diǎn)重疊)，并因此據(jù)說dsbi/ssbi酶的切割位點(diǎn)位于其識別位點(diǎn)處或附近。dsbi/ssbi酶的識別位點(diǎn)，有時(shí)也稱為結(jié)合位點(diǎn)，是由dsbi/ssbi酶(特異性)識別并確定其結(jié)合特異性的核苷酸序列。例如，talen或znf單體具有分別由其rvd重復(fù)或zf重復(fù)確定的識別位點(diǎn)，而其切割位點(diǎn)由其核酸酶結(jié)構(gòu)域(例如，foki)確定，并且通常位于識別位點(diǎn)之外。在二聚talen或zfn的情況下，切割位點(diǎn)位于相應(yīng)單體的兩個(gè)識別/結(jié)合位點(diǎn)之間，在此發(fā)生切割的該間插dna或rna區(qū)域稱為間隔區(qū)域。

37、本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠選擇識別特定識別位點(diǎn)并在預(yù)選/預(yù)定位點(diǎn)處或附近的切割位點(diǎn)處誘導(dǎo)dsb或ssb的dsbi/ssbi酶，或工程化此類dsbi/ssbi酶。可選地，可以使用任何常規(guī)轉(zhuǎn)化方法或通過與在其基因組中具有dsbi/ssbi酶識別位點(diǎn)的生物體雜交，將dsbi/ssbi酶識別位點(diǎn)導(dǎo)入靶基因組中，并然后可以在dsbi/ssbi酶的切割位點(diǎn)處或附近導(dǎo)入任何期望的核酸。

38、存在修復(fù)斷裂的兩個(gè)主要及獨(dú)特的途徑-同源重組和非同源末端連接(nhej)。同源重組需要作為模板的同源序列(例如“供體”)的存在以指導(dǎo)細(xì)胞修復(fù)過程，并且修復(fù)的結(jié)果是無錯誤且可預(yù)測的。在用于同源重組的模板(或“供體”)序列缺失時(shí)，細(xì)胞通常嘗試通過非同源末端連接(nhej)過程修復(fù)斷裂。

39、在該實(shí)施方案的特別優(yōu)選的方面，將修復(fù)核酸分子額外地導(dǎo)入植物細(xì)胞中。如本文所用，“修復(fù)核酸分子”是單鏈或雙鏈dna分子或rna分子，其用作修飾切割位點(diǎn)處或附近的預(yù)選位點(diǎn)處的基因組dna或rna的模板。如本文所用，“用作修飾基因組dna的模板”是指通過在預(yù)選位點(diǎn)側(cè)翼靶基因組中的側(cè)翼區(qū)域和相應(yīng)的同源區(qū)域之間的同源重組，任選地與修復(fù)核酸分子的兩端中的一端處的非同源末端連接(nhej)組合(例如在只有一個(gè)側(cè)翼區(qū)域的情況下)，而在預(yù)定位點(diǎn)復(fù)制或整合修復(fù)核酸分子。通過同源重組的整合將允許修復(fù)核酸分子精確地連接至靶基因組直至核苷酸水平，而nhej可導(dǎo)致修復(fù)核酸分子與基因組dna之間的連接處的小插入/缺失。

40、如本文所用，“基因組的修飾”是指基因組已經(jīng)在至少一個(gè)核苷酸被改變。這可以通過插入轉(zhuǎn)基因，優(yōu)選地為包含感興趣的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒，取代至少一個(gè)核苷酸和/或缺失至少一個(gè)核苷酸和/或插入至少一個(gè)核苷酸而發(fā)生，只要與修飾前的預(yù)選基因組靶位點(diǎn)的核苷酸序列相比導(dǎo)致至少一個(gè)核苷酸的總改變，從而允許鑒定修飾，例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的諸如測序或pcr分析等的技術(shù)。

41、如本文所用，“預(yù)選位點(diǎn)”、“預(yù)定位點(diǎn)”或“預(yù)定義位點(diǎn)”表示在基因組(例如，核基因組或葉綠體基因組)中的特定核苷酸序列，在該位置期望插入、取代和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸。這可以例如是在先前導(dǎo)入的外來dna、rna或轉(zhuǎn)基因中或與之連接的內(nèi)源基因座或特定核苷酸序列。預(yù)選位點(diǎn)可以是特定的核苷酸位置，在該位置(在該位置之后)意在制造一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入。預(yù)選位點(diǎn)還可以包含待交換(取代)或缺失的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的序列。

42、如在本技術(shù)的上下文中使用的，術(shù)語“約”是指所述值的+/-10％，優(yōu)選地指所述值的+/-5％。例如，應(yīng)將約100個(gè)核苷酸(nt)理解為90nt和110nt之間的值，優(yōu)選地為95nt和105nt之間。

43、如本文所用，“側(cè)翼區(qū)域”是具有與位于預(yù)選位點(diǎn)側(cè)翼(即上游或下游)的dna區(qū)域的核苷酸序列同源的核苷酸序列的修復(fù)核酸分子的區(qū)域。顯然應(yīng)該選擇側(cè)翼區(qū)域的長度和序列相同性百分比，以使得能夠在所述側(cè)翼區(qū)域與它們在預(yù)選位點(diǎn)上游或下游的相應(yīng)dna區(qū)域之間進(jìn)行同源重組。與修復(fù)核酸分子的一個(gè)或多個(gè)側(cè)翼dna區(qū)域具有同源性的位于預(yù)選位點(diǎn)側(cè)翼的一個(gè)或多個(gè)dna區(qū)域也被稱為基因組dna中的一個(gè)或多個(gè)同源區(qū)域。

44、為了具有足夠的重組同源性，修復(fù)核酸分子的側(cè)翼dna區(qū)域的長度可有所不同，并且長度應(yīng)至少為約10nt、約15nt、約20nt、約25nt、約30nt、約40nt或約50nt。然而，側(cè)翼區(qū)域可以盡可能長(例如，高達(dá)約100-150kb，例如完整的細(xì)菌人工染色體(bac))。優(yōu)選地，側(cè)翼區(qū)域?qū)榧s50nt至約2000nt，例如約100nt、200nt、500nt或1000nt。此外，位于感興趣的dna側(cè)翼的區(qū)域不必與同源區(qū)域(位于預(yù)選位點(diǎn)側(cè)翼的dna區(qū)域)相同，并且可具有與位于預(yù)選位點(diǎn)側(cè)翼的dna區(qū)域約80％至約100％的序列相同性，優(yōu)選地具有約95％至約100％的序列相同性。側(cè)翼區(qū)域越長，對同源性的要求越不嚴(yán)格。此外，為了實(shí)現(xiàn)預(yù)選位點(diǎn)處的靶dna序列的交換而不改變相鄰dna序列的dna序列，側(cè)翼dna序列應(yīng)優(yōu)選與位于預(yù)選位點(diǎn)側(cè)翼的上游和下游dna區(qū)域相同。

45、如本文所用，“上游”表示核酸分子上更靠近所述核酸分子的5'端的位置。同樣地，術(shù)語“下游”是指核酸分子上更靠近所述核酸分子的3'端的位置。為避免疑問，核酸分子及其序列通常以其5'至3'方向(從左至右)表示。

46、為了在預(yù)選位點(diǎn)處的靶序列修飾，必須選擇側(cè)翼區(qū)域，使得上游側(cè)翼區(qū)域的3'端和/或下游側(cè)翼區(qū)域的5'端與預(yù)定義位點(diǎn)的端部對齊。這樣，上游側(cè)翼區(qū)域的3'端確定預(yù)定義位點(diǎn)的5'端，而下游側(cè)翼區(qū)域的5'端確定預(yù)定義位點(diǎn)的3'端。

47、如本文所用，所述預(yù)選位點(diǎn)位于所述切割(和/或識別)位點(diǎn)之外或遠(yuǎn)離所述切割(和/或識別)位點(diǎn)，是指意欲在此進(jìn)行基因組修飾的位點(diǎn)(預(yù)選位點(diǎn))不包含切割位點(diǎn)和/或dsbi/ssbi酶的識別位點(diǎn)，即預(yù)選位點(diǎn)與切割(和/或識別)位點(diǎn)不重疊。因此，在這方面，之外/遠(yuǎn)離是指切割(和/或識別)位點(diǎn)的上游或下游。

48、如本文所用，“堿基編輯器(base?editor)”是指具有與其衍生的蛋白質(zhì)相同催化活性的蛋白質(zhì)或其片段，該蛋白質(zhì)或其片段單獨(dú)或以分子復(fù)合物(在本文中稱為堿基編輯復(fù)合物)提供時(shí)具有介導(dǎo)靶向堿基修飾的能力，即如果堿基轉(zhuǎn)變(conversion)未引起沉默突變而是引起由包含待用堿基編輯器轉(zhuǎn)變的位置的密碼子所編碼的氨基酸的轉(zhuǎn)變，感興趣的堿基的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致感興趣的點(diǎn)突變，進(jìn)而能導(dǎo)致靶向突變。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的至少一種堿基編輯器與至少一種位點(diǎn)特異性dsbi/ssbi酶復(fù)合物或至少一種修飾的位點(diǎn)特異性dsbi/ssbi酶復(fù)合物或任選地與所述至少一種位點(diǎn)特異性dsbi/ssbi酶復(fù)合物的組分暫時(shí)或永久連接。所述連接可以是共價(jià)和/或非共價(jià)的。

49、可以將本文公開的任何堿基編輯器或位點(diǎn)特異性dsbi/ssbi酶復(fù)合物或其催化活性片段，或堿基編輯器復(fù)合物的任何組分或位點(diǎn)特異性dsbi/ssbi酶復(fù)合物的任何組分可作為核酸片段導(dǎo)入細(xì)胞，所述核酸片段代表或編碼dna、rna或蛋白質(zhì)效應(yīng)物，或其可以作為dna、rna和/或蛋白質(zhì)或其任何組合導(dǎo)入。

50、堿基編輯器是具有介導(dǎo)靶向的堿基修飾(即，導(dǎo)致感興趣的點(diǎn)突變的感興趣的堿基的轉(zhuǎn)變)能力的蛋白質(zhì)或其片段。優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，將至少一個(gè)堿基編輯器暫時(shí)或永久地融合至至少一個(gè)dsbi/ssbi酶，或任選地融合至至少一個(gè)dsbi/ssbi的組分。融合可以是共價(jià)和/或非共價(jià)的。多個(gè)出版物已顯示靶向的堿基轉(zhuǎn)變(主要從胞嘧啶(c)轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏?t))，其使用與胞苷脫氨酶結(jié)構(gòu)域(載脂蛋白b?mrna編輯催化多肽(apobec1)(例如來自大鼠的apobec))連接的crispr/cas9切口酶或非功能性核酸酶。由胞嘧啶脫氨酶催化胞嘧啶(c)的脫氨基，并產(chǎn)生具有胸腺嘧啶(t)的堿基配對特性的尿嘧啶(u)。大多數(shù)已知的胞苷脫氨酶作用于rna上，并且已知接受dna的少數(shù)實(shí)例需要單鏈(ss)dna。對dcas9-靶dna復(fù)合物的研究揭示，在形成cas9-向?qū)na-dna“r-環(huán)”復(fù)合物后，被取代的dna鏈的至少九個(gè)核苷酸(nt)不配對(jore?et等,nat.struct.mol.biol.,18,529-536(2011))。確實(shí)，在cas9?r-環(huán)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)中，被取代的dna鏈上的前間隔序列的前11個(gè)nt是無序的，其表明它們的運(yùn)動不被高度限制。還已經(jīng)推測，cas9切口酶誘導(dǎo)的在非模板鏈的胞嘧啶中的突變可能是由細(xì)胞胞嘧啶脫氨酶對它們的可及性引起。有理由認(rèn)為，r-環(huán)中此ssdna片段的子集可以作為dcas9-連接的胞苷脫氨酶的有效底物以實(shí)現(xiàn)dna中c到u的直接可編程轉(zhuǎn)變(komor等，同上)。最近，goudelli等((2017),programmable?base?editing?of?a·t?to?g·c?ingenomic?dna?without?dna?cleavage,nature,551(7681),464)，描述了介導(dǎo)基因組dna中的a·t至g·c轉(zhuǎn)變的腺嘌呤堿基編輯器(abe)。

51、在本領(lǐng)域中已經(jīng)鑒定了影響dna甲基化的酶以及組蛋白修飾酶。組蛋白翻譯后修飾在調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)中起重要作用。例如，在sterner?de，berger?sl(2000年6月):“acetylation?of?histones?and?transcription-related?factors”,microbiol.mol.biol.rev.64(2):435–59中描述的用于組蛋白乙?；拿浮Ｓ绊懡M蛋白甲基化的酶描述于zhang?y.，reinberg?d(2001)：“transcription?regulation?by?histonemethylation:interplay?between?different?covalent?modifications?of?the?corehistone?tails”,genes?dev.15(18):2343–60。組蛋白的泛素化描述于shilatifard?a(2006):“chromatin?modifications?by?methylation?and?ubiquitination:implications?in?the?regulation?of?gene?expression”,annu.rev.biochem.75:243–69。用于組蛋白磷酸化的酶描述于nowak?sj.,corces?vg.(2004年4月):“phosphorylationof?histone?h3:a?balancing?act?between?chromosome?condensation?andtranscriptional?activation”,trends?genet.20(4):214–20。用于組蛋白sumo化的酶描述于nathan?d.,ingvarsdottir?k.,sterner?de.等，(2006年4月):“histone?sumoylationis?a?negative?regulator?in?saccharomyces?cerevisiae?and?shows?dynamicinterplay?with?positive-acting?histone?modifications”,genes?dev.20(8):966–76。用于組蛋白核糖基化的酶描述于hassa?po.,haenni?ss.,elser?m,hottiger?mo.(2006年9月):“nuclear?adp-ribosylation?reactions?in?mammalian?cells:where?are?we?todayand?where?are?we?going？”,microbiol.mol.biol.rev.70(3):789–829。組蛋白瓜氨酸化被例如稱為肽基精氨酸脫亞胺酶4(pad4，也稱為padi4)的酶催化，其將組蛋白精氨酸(arg)和單甲基精氨酸殘基兩者轉(zhuǎn)化為瓜氨酸。

52、可將影響dna甲基化的酶和組蛋白修飾酶與解除武裝的dsb或ssb誘導(dǎo)酶融合，其優(yōu)選識別所述細(xì)胞的基因組中的預(yù)定位點(diǎn)。

53、表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)

54、如本文所用，“表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)”是指參與調(diào)控植物細(xì)胞的表觀遺傳狀態(tài)(例如dna甲基化、蛋白質(zhì)甲基化，特別是組蛋白甲基化、以及乙?；貏e是組蛋白乙?；?的任何化學(xué)物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施方案，表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)脫乙?；敢种苿?ii.1)是與基因組工程化組分共同導(dǎo)入。根據(jù)本發(fā)明所用的優(yōu)選的表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)是組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci)諸如曲古抑菌素a(tsa)或dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。如本文所用，“組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci)”是指抑制組蛋白脫乙酰基酶活性的任何物質(zhì)，“dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑”是指抑制dna甲基轉(zhuǎn)移酶活性的任何物質(zhì)。

55、據(jù)假設(shè)共同遞送的表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)(ii.1)(特別是hdaci)松弛植物的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)轟擊的細(xì)胞中對基因組工程化組分的dna可及性，因而接著促進(jìn)基因組工程化(即轉(zhuǎn)化和基因組編輯)效率。這種假設(shè)的原因是：遺傳物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能單元是核小體，其中帶負(fù)電荷的dna包裹在帶正電荷的組蛋白八聚體和相關(guān)的連接子組蛋白周圍。核小體單元進(jìn)一步折疊并堆積成染色質(zhì)(andrews,a.j.,和luger,k.(2011).nucleosomestructure(s)and?stability:variations?on?a?theme.annu.rev.biophys.40:99–117)。dna可及性很大程度上取決于核小體和染色質(zhì)的緊密度。染色質(zhì)重塑酶可動態(tài)修飾組蛋白的賴氨酸或其他氨基酸，其導(dǎo)致它們電荷以及與dna和其他蛋白質(zhì)的相互作用的改變，并導(dǎo)致染色質(zhì)折疊或解折疊(bannister?aj.,kouzarides?t.(2011)regulation?of?chromatinby?histone?modifications.cell?res?21:381–95)。通過添加或去除乙酰基，組蛋白中賴氨酸殘基的乙酰化和脫乙?；ǔ⑴c真核生物中染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的可逆調(diào)節(jié)，并介導(dǎo)染色質(zhì)可及性和基因表達(dá)調(diào)控。組蛋白脫乙酰基酶(hdac)是從位于組蛋白的n末端尾部的賴氨酸殘基去除乙?；拿?，其使組蛋白帶更多正電荷，并因此允許組蛋白更緊地包裹dna。抑制hdac可能有助于染色質(zhì)解折疊，并使dna更易接近。

56、染色質(zhì)重塑和其他表觀遺傳修飾無疑在調(diào)控細(xì)胞全能和再生中起重要作用(zhang,h.,和ogas,j.(2009).an?epigenetic?perspective?on?developmentalregulation?of?seed?genes.mol.plant?2:610–627)。已經(jīng)證明組蛋白脫乙?；?hdac)活性的抑制與植物再生和小孢子胚胎發(fā)生有關(guān)(miguel,c.,和l.marum,2011.anepigenetic?view?of?plant?cells?cultured?in?vitro:somaclonal?variation?andbeyond.j.exp.bot.62:3713–3725.,li?hui?et?al.(2014)the?histone?deacetylaseinhibitor?trichostatin?a?promotes?totipotency?in?the?male?gametophyte?plantcell,26:195–209)。hdac活性或下游hdac介導(dǎo)的途徑的抑制在起始應(yīng)激誘導(dǎo)的單倍體胚胎發(fā)生中起主要作用。一種這樣的hdaci是曲古抑菌素a(tsa)。已證明tsa在歐洲油菜的雄配子體中誘導(dǎo)大量的胚胎發(fā)生細(xì)胞增殖。tsa處理導(dǎo)致培養(yǎng)的小孢子和花粉中高頻率的孢子體細(xì)胞分裂。

57、本文件描述了方法以在一種或多種表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)例如蛋白脫乙酰酶抑制劑特別是hdaci存在下，來提高基因組工程化效率。這樣的hdaci可以是曲古抑菌素a(tsa)、n-羥基-7-(4-二甲基氨基苯甲?；?-氨基庚酰胺(m344)、辛二酰苯胺異羥肟酸(saha)或其他。這些hdaci選自基于異羥肟酸(ha)的化學(xué)物質(zhì)，其目標(biāo)是鋅依賴性hdac。

58、植物激素

59、根據(jù)本發(fā)明的第二實(shí)施方案，將一種或多種植物激素(ii.2)，例如生長素和細(xì)胞分裂素，例如2,4-d、6-芐基氨基嘌呤(6-ba)和玉米素，與基因組工程化組分(i)共同遞送。如本文所用，“植物激素”是指促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和/或植物形態(tài)發(fā)生的任何天然存在或合成的材料和化學(xué)物質(zhì)。

60、植物體細(xì)胞能夠通過體細(xì)胞胚胎發(fā)生或器官發(fā)生而在體外培養(yǎng)中恢復(fù)細(xì)胞分裂并再生為整個(gè)植物，這主要取決于植物激素諸如生長素和細(xì)胞分裂素。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)植物激素促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高植物細(xì)胞對基因組工程化的敏感性，并因此改善基因組工程化(即轉(zhuǎn)化和基因組編輯)的效率。

61、生長素之一是2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)，其對于單子葉植物例如玉米和小麥中的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和細(xì)胞再生幾乎是必不可少的。同時(shí)，細(xì)胞分裂素例如6芐基氨基嘌呤(6-ba)或玉米素對植物器官發(fā)生、和芽分生組織的萌生和發(fā)育是必需的。本文件描述了通過與基因組工程化組分共同遞送一種或多種植物激素(2,4-d、6-ba、玉米素等)來改善基因組工程化效率的方法。

62、再生加強(qiáng)基因

63、根據(jù)本發(fā)明的第三實(shí)施方案，與基因組工程化組分(i)共同導(dǎo)入引起從體細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞或胚性細(xì)胞的植物再生得以改善的蛋白質(zhì)或包含編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)盒(ii.3)。這類型的化合物(ii.3)在本文中也稱為“再生加強(qiáng)基因”。

64、據(jù)信轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的可再生性比野生型細(xì)胞低。由于細(xì)胞內(nèi)存在外來dna，轉(zhuǎn)化的細(xì)胞容易受到程序性細(xì)胞死亡。遞送(例如轟擊破壞)引起的應(yīng)激也可能引發(fā)細(xì)胞死亡。因此，促進(jìn)細(xì)胞分裂對于修飾的細(xì)胞的再生是必需的。此外，基因組工程化效率很大程度上由宿主細(xì)胞狀態(tài)控制。經(jīng)歷快速細(xì)胞分裂的細(xì)胞(像植物分生組織中的那些)是基因組工程化的最合適受體。促進(jìn)細(xì)胞分裂將可能會提高dna復(fù)制和分裂過程中的dna整合或修飾，并因而提高基因組工程化效率。

65、基于它們在促進(jìn)細(xì)胞分裂和植物形態(tài)發(fā)生中所起的作用來選擇加強(qiáng)基因。每個(gè)候選基因均由強(qiáng)組成型啟動子克隆和驅(qū)動，并通過在玉米細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)來評估而無需選擇。加強(qiáng)基因的實(shí)例是plt5(plethora5；seq?id?no：1、2、13和14)、plt7(plethora7；seq?idno：3、4、15和16)和rkd基因(rkd2：seq?id?no：5、6、29、30、31和32；rkd4：seq?id?no：11、12、17、18、27和28；例如waki,t.,hiki,t.,watanabe,r.,hashimoto,t.,&nakajima,k.(2011).the?arabidopsis?rwp-rk?protein?rkd4?triggers?gene?expression?and?patternformation?in?early?embryogenesis.current?biology,21(15),1277-1281)

66、plt(plethora)，也稱為ail(aintegument-like)基因，是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ap2家族的成員。轉(zhuǎn)錄因子ap2家族成員在植物的細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)生中起重要作用(el?ouakfaoui,s.,schnell,j.,abdeen,a.,colville,a.,labbé,h.,han,s.,baum,b.,laberge,s.,miki,b(2010)control?of?somatic?embryogenesis?and?embryo?development?byap2transcription?factors.plant?molecular?biology?74(4-5):313-326.)。plt基因主要在芽和根的發(fā)育組織中表達(dá)，且是干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞分裂和再生，以及器官原基模式化所必需的。

67、plt家族包含有六個(gè)成員的ap2子分支。四個(gè)plt成員，plt1/ail3(seq?id?no：19和20)、plt2/ail4(seq?id?no：21和22)、plt3/ail6(seq?id?no：9、10、23和24)和bbm/plt4/ail2(seq?id?no：7、8、25和26)在根尖分生組織(ram)中部分重疊表達(dá)，并且是在干細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)在正確的位置表達(dá)qc(靜止中心)標(biāo)志物所需的。這些基因?qū)S持根尖分生組織的細(xì)胞分裂和防止細(xì)胞分化起冗余作用。

68、三個(gè)plt基因，plt3/ail6，plt5/ail5和plt7/ail7在芽尖分生組織(shoot?apicalmeristem)(sam)中表達(dá)，它們在側(cè)生器官(lateral?organ)的定位和外生長(outgrowth)中起冗余作用。plt3、plt5和plt7通過控制兩個(gè)不同的發(fā)育事件來調(diào)節(jié)擬南芥中的新生芽再生。plt3、plt5和plt7是在分生組織的外圍維持高水平的pin1表達(dá)所需的，并調(diào)節(jié)sam中央?yún)^(qū)域的局部生長素生成，這是葉序轉(zhuǎn)換(phyllotactic?transition)的基礎(chǔ)。這三個(gè)基因功能的累積喪失導(dǎo)致中間細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織不能形成芽祖細(xì)胞，而誘導(dǎo)plt5或plt7則可以以激素非依賴性方式使芽再生。plt3，plt5，plt7調(diào)節(jié)并需要芽促進(jìn)因子cup-shapedcotyledon2(cuc2)來完成芽形成程序。plt3，plt5和plt7也在側(cè)根生成細(xì)胞(lateral?rootfounder?cells)中表達(dá)，在側(cè)根生成細(xì)胞中它們?nèi)哂嗟丶せ頿lt1和plt2的表達(dá)，并接著調(diào)節(jié)側(cè)根形成。

69、根據(jù)本發(fā)明，一種蛋白質(zhì)引起從體細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞或胚性細(xì)胞的植物再生得以改善，優(yōu)選地其包含選自以下的氨基酸序列

70、a)如seq?id?no：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31中任何一個(gè)所示的序列，

71、b)具有與(a)的序列至少60％相同性的序列，

72、c)由如seq?id?no：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32中任何一個(gè)所示的核酸序列編碼的序列，和

73、d)由具有與(c)的核酸序列至少60％相同性的核酸序列編碼的序列。

74、e)由在嚴(yán)格條件下與與c)所定義的核酸序列互補(bǔ)的序列進(jìn)行雜交的核酸序列所編碼的序列。

75、對于上述(b)的氨基酸序列或(d)的核酸序列，整個(gè)序列長度上的序列相同性優(yōu)選為至少70％、至少75％、至少80％，更優(yōu)選至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％。

76、為了本發(fā)明的目的，兩個(gè)相關(guān)核苷酸或氨基酸序列的“序列相同性”(以百分比表示)是指在兩個(gè)具有相同殘基(x100)的最優(yōu)比對序列中的位置數(shù)除以比較的位置數(shù)。缺口，即在一個(gè)序列中存在而另一個(gè)序列不存在的殘基的比對中的位置，被認(rèn)為是具有非相同殘基的位置。通過needleman和wunsch算法(needleman和wunsch?1970)進(jìn)行兩個(gè)序列的比對。上面的計(jì)算機(jī)輔助序列比對可以使用標(biāo)準(zhǔn)軟件程序諸如在european?molecular?biologyopen?software?suite(emboss)如版本6.3.1.2(trends?in?genetics?16(6),276(2000))(其默認(rèn)參數(shù)例如為對于蛋白質(zhì)矩陣＝eblosum62，gapopen＝10.0以及gapextend＝0.5)中實(shí)施的needle程序方便地進(jìn)行。

77、如本文所用，術(shù)語“雜交”是指通過互補(bǔ)核苷酸的堿基配對在兩個(gè)核酸分子之間雜交體的形成。術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”是指在特定條件下的雜交。這樣的條件的一個(gè)實(shí)例包括這樣的條件，在該條件下，基本上的互補(bǔ)鏈(即由具有至少80％互補(bǔ)性的核苷酸序列組成的鏈)與給定的鏈雜交，而較低互補(bǔ)鏈不雜交?？蛇x地，這些條件是指鈉鹽濃度、溫度和洗滌條件的特定雜交條件。例如，高度嚴(yán)格的條件包含在42℃、50％甲酰胺、5x?ssc(150mmnacl、15mm檸檬酸三鈉)、50mm磷酸鈉、5x?denhardt溶液、10x硫酸葡聚糖、20mg/ml剪切的鮭魚精子dna中孵育并在約65℃的0.2x?ssc(ssc代表0.15m氯化鈉和0.015m檸檬酸三鈉緩沖液)中洗滌?？蛇x地，高度嚴(yán)格的條件可意指在68℃于0.25m磷酸鈉、ph7.2、7％sdds、1mmedta和1％bsa中雜交16小時(shí)，并在68℃用2?x?ssc和0.1％sdds洗滌兩次。進(jìn)一步可選地，高度嚴(yán)格的雜交條件例如是：在65℃在4×ssc中雜交，并然后在65℃在0.1×ssc中多次洗滌總共約1小時(shí)，或在68℃在0.25m磷酸鈉、ph7.2、7％sds、1mm?edta和1％bsa中雜交16小時(shí)，并然后在68℃用2x?ssc和0.1％sds洗滌兩次。

78、共同導(dǎo)入

79、用于在植物細(xì)胞中遺傳修飾的本發(fā)明的方法的特征在于，將基因組工程化組分(i)與化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的至少一個(gè)共同導(dǎo)入進(jìn)一個(gè)植物細(xì)胞。

80、如本文所用，“共同遞送”或“共同-遞送”和“共同導(dǎo)入”或“共同-導(dǎo)入”可互換使用。就本發(fā)明而言，“共同導(dǎo)入”是指這樣的過程，其中至少兩個(gè)不同的組分同時(shí)被遞送進(jìn)同一植物細(xì)胞中。因此，基因組工程化組分(i)與化合物(ii.1)、(ii.2)和/或(ii.3)一起導(dǎo)入同一植物細(xì)胞中。優(yōu)選地，兩種類型的組分/化合物均通過共同的構(gòu)建體導(dǎo)入。

81、可以通過粒子轟擊、顯微注射、農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、電穿孔、農(nóng)桿菌滲入或真空滲入來共同導(dǎo)入進(jìn)植物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明，基于物理遞送(如粒子轟擊、顯微注射、電穿孔、納米顆粒和細(xì)胞穿透肽(cpp))的方法特別優(yōu)選用于共同導(dǎo)入組分(i)和化合物(ii)。特別優(yōu)選的是通過粒子轟擊共同導(dǎo)入。

82、如本文所用，術(shù)語“粒子轟擊”，也稱為“基因槍法轉(zhuǎn)染”或“微粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移”，是指一種用于將包含感興趣的構(gòu)建體的包被微?；蚣{米顆粒轉(zhuǎn)移進(jìn)靶細(xì)胞或組織中的物理遞送方法。為了用于本發(fā)明，感興趣的構(gòu)建體包含基因組工程化組分(i)和化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的至少一個(gè)。微米或納米顆粒起射彈的作用，并使用合適的裝置(通常稱為基因槍)在高壓下發(fā)射到感興趣的靶結(jié)構(gòu)上。通過粒子轟擊進(jìn)行的轉(zhuǎn)化使用包被有感興趣的構(gòu)建體的金屬微彈(microprojectile)，然后使用稱為“基因槍(gene?gun)”的設(shè)備(sandford等，1987)以足夠快的高速(～1500km/h)將其發(fā)射到靶細(xì)胞上，以穿透靶組織細(xì)胞壁，但不夠嚴(yán)酷以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。對于原生質(zhì)體，其細(xì)胞壁被完全去除，條件在邏輯上是不同的。至少一個(gè)微彈上的沉淀的構(gòu)建體在轟擊后釋放到細(xì)胞中。微彈的加速是通過高壓放電或壓縮氣體(氦氣)來實(shí)現(xiàn)的。關(guān)于所使用的金屬顆粒，它們必須是無毒的，無反應(yīng)的，并且其直徑小于靶細(xì)胞的直徑。最常用的是金或鎢。從基因槍及其相關(guān)系統(tǒng)的制造商和供應(yīng)商可以公開獲得大量有關(guān)其一般用途的信息。

83、在微粒轟擊的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，一種或多種化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)與基因組工程化組分(i)是通過包含具有0.4-1.6微米(μm)范圍大小，優(yōu)選0.4-1.0μm范圍大小的金顆粒的微載體共同遞送的。在示例性方法中，每一次轟擊使用10-1000μg的金顆粒，優(yōu)選50-300μg。

84、可以例如使用bio-rad?pds-1000/he粒子槍或手持式helios基因槍系統(tǒng)將化合物(ii)與基因組工程化組分(i)遞送進(jìn)靶細(xì)胞中。當(dāng)使用pds-1000/he粒子槍系統(tǒng)時(shí)，轟擊破裂壓力為450psi至2200psi，優(yōu)選為450-1100psi，而helios基因槍系統(tǒng)的破裂壓力為100-600psi?？梢酝瑫r(shí)將一種以上的化學(xué)物質(zhì)或構(gòu)建體與基因組工程化組分共同遞送到進(jìn)細(xì)胞中。

85、培養(yǎng)步驟

86、在本發(fā)明方法的步驟b)中，在至少一種化合物(ii)的存在下，通過基因組工程化組分的活性，在允許所述植物細(xì)胞的基因組的遺傳修飾的條件下，培養(yǎng)已共同導(dǎo)入基因組工程化組分(i)和至少一種化合物(ii)的植物細(xì)胞。

87、如本文所用，“基因組的遺傳修飾”包括任何類型的操作，使得內(nèi)源核苷酸已被改變以包括突變諸如缺失、插入、轉(zhuǎn)換(transition)、顛換(transversion)或其組合。例如，可以缺失內(nèi)源編碼區(qū)域。此類突變可導(dǎo)致多肽具有與內(nèi)源多核苷酸編碼的氨基酸序列不同的氨基酸序列。遺傳修飾的另一個(gè)實(shí)例是調(diào)控序列諸如啟動子的改變以導(dǎo)致提高或減少可操作連接的內(nèi)源編碼區(qū)域的表達(dá)。

88、“適合”植物基因組的遺傳修飾發(fā)生的條件諸如多核苷酸的切割，或“適合”條件是不能阻止此類事件發(fā)生的條件。因此，這些條件允許、增強(qiáng)、促進(jìn)和/或有助于事件。根據(jù)各個(gè)基因組工程化組分(i)，這些條件可不同。

89、在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選用基因組工程化組分(i)和至少一種化合物(ii)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。如本文所用，“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”是指外來材料[即核酸片段、蛋白質(zhì)、核糖核蛋白(rnp)等]轉(zhuǎn)移進(jìn)宿主細(xì)胞而導(dǎo)致基因表達(dá)和/或活性，而沒有整合和穩(wěn)定遺傳外來材料。因此，基因組工程化組分(i)在植物細(xì)胞中是瞬時(shí)有活性的和/或是瞬時(shí)存在的。基因組工程化組分不是永久性地并入細(xì)胞基因組中而是提供暫時(shí)的作用以導(dǎo)致基因組的修飾。例如，基因組工程化組分在植物細(xì)胞中的瞬時(shí)活性和/或瞬時(shí)存在可導(dǎo)致在植物細(xì)胞的基因組中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)雙鏈斷裂、在植物細(xì)胞的基因組中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)單鏈斷裂、在植物細(xì)胞的基因組中導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)堿基編輯事件、或在植物細(xì)胞的基因組中導(dǎo)入以下的一個(gè)或多個(gè)：dna甲基化、組蛋白乙?；⒔M蛋白甲基化、組蛋白泛素化、組蛋白磷酸化、組蛋白sumo化、組蛋白核糖基化或組蛋白瓜氨酸化。

90、優(yōu)選在導(dǎo)入一個(gè)或多個(gè)雙鏈斷裂或一個(gè)或多個(gè)單鏈斷裂之后為非同源n連接(nhij)和/或?yàn)橥ㄟ^同源重組機(jī)制對一個(gè)或多個(gè)斷裂的同源定向修復(fù)。

91、植物細(xì)胞的基因組中的所得修飾可以例如選自轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選地為包含感興趣的基因的表達(dá)盒)的插入，至少一個(gè)核苷酸的取代，至少一個(gè)核苷酸的缺失，至少一個(gè)核苷酸的插入，dna甲基化的改變，組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、組蛋白泛素化、組蛋白磷酸化、組蛋白sumo化、組蛋白核糖基化或組蛋白瓜氨酸化的改變，或其組合。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的方面，沒有與所應(yīng)用的基因編輯機(jī)制/系統(tǒng)有關(guān)的外源遺傳物質(zhì)被穩(wěn)定地整合進(jìn)植物細(xì)胞的基因組中。

92、遺傳修飾可以是植物細(xì)胞基因組中的永久且可遺傳的改變。

93、任選的預(yù)處理

94、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，通過在含有一種或多種化合物(ii)的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)植物材料，在共同導(dǎo)入步驟(a)之前，可以包括用一種或多種化學(xué)物質(zhì)例如化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的一個(gè)或多個(gè)對植物材料預(yù)處理。因此，用于在植物細(xì)胞中遺傳修飾的方法可以進(jìn)一步包含對待用于步驟(a)的植物細(xì)胞的預(yù)處理的步驟，所述預(yù)處理包含在含有(ii.1)表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)或其活性衍生物，特別是組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci)或dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，(ii.2)植物激素或其活性衍生物，(ii.3)引起從愈傷組織或胚性組織的植物再生得到改善的蛋白質(zhì)，或其任何組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)植物細(xì)胞或包含其的植物材料。

95、在預(yù)處理步驟之后，從含有化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的至少一種的培養(yǎng)基中提取處理過的植物細(xì)胞，并用于共同導(dǎo)入步驟(a)。

96、作為示例，對于組蛋白脫乙?；敢种苿﹖sa，hdaci預(yù)處理的持續(xù)時(shí)間為10分鐘至2天，優(yōu)選2.0小時(shí)至24小時(shí)。用于預(yù)處理的tsa濃度為1.0nm至1000nm，優(yōu)選10nm至100nm。此后，將處理過的植物材料轉(zhuǎn)移至無hdaci的培養(yǎng)基中，并立即用于tsa共同導(dǎo)入(延長時(shí)間的tsa預(yù)處理可能會造成非選擇性地增強(qiáng)細(xì)胞再生，這可能會提高回收被轟擊和修飾的細(xì)胞的難度)。

97、相似的預(yù)處理?xiàng)l件可以應(yīng)用于所有類型的化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)。植物組織培養(yǎng)和基因組工程化可以使用目前可用的方法進(jìn)行?？梢允褂眉t色熒光報(bào)告基因tdtomato(其編碼異常亮的紅色熒光蛋白，其激發(fā)最大值為554nm且發(fā)射最大值為581nm)或綠色熒光報(bào)告基因mneongreen(其編碼最亮的單體綠色或黃色熒光蛋白，其最大激發(fā)波長為506nm，且最大發(fā)射波長為517nm)來監(jiān)測瞬時(shí)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因表達(dá)?；蚪M編輯效率可以例如通過下一代測序(ngs)來分析。

98、微粒

99、在本發(fā)明的上下文中，發(fā)現(xiàn)對于將組分(i)和(ii)共同導(dǎo)入植物細(xì)胞，用兩種組分包被的微粒是特別合適的。因此，根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種用至少以下包被的微粒

100、(i)基因組工程化組分和

101、(ii)第二化合物，其包含

102、(ii.1)表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)脫乙?；敢种苿┗蚱浠钚匝苌铮貏e是組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci)，和/或

103、(ii.2)植物激素或其活性衍生物，和/或

104、(ii.3)引起從體細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞或胚性細(xì)胞的植物再生得以改善的蛋白質(zhì)或包含編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)盒。

105、微粒由無毒、無反應(yīng)的材料組成。優(yōu)選地，微粒包括金屬諸如金或鎢。微粒的大小可以在0.4-1.6微米(μm)的范圍，優(yōu)選0.4-1.0μ的范圍。

106、具有組分(i)和(ii)的包被可以包含一個(gè)或多個(gè)包被層。例如，微?？珊邪蚪M工程化組分(i)的第一包被層和包含化合物(ii.1)、(ii.2)和/或(ii.3)的第二包被層。可選地，微?？珊邪蚪M工程化組分(i)和化合物(ii.1)、(ii.2)和(ii.3)中的至少一種的包被層。

107、另外，本發(fā)明提供一種通過微彈(microprojectile)轟擊來遺傳修飾植物基因組的試劑盒，其包含

108、(i)一個(gè)或多個(gè)微粒，和

109、(ii)用于用至少基因組工程化組分和(1)表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)(例如dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或蛋白質(zhì)脫乙酰基酶抑制劑，特別是組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci))或其活性衍生物，和/或(2)植物激素或其活性衍生物，和/或(3)引起從愈傷組織或胚性組織的植物再生得以改善的蛋白質(zhì)或包含編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)盒包被所述微粒的工具。

110、本發(fā)明的另一方面是如上所述的微粒在植物細(xì)胞的基因槍法轉(zhuǎn)化中的用途。

111、本發(fā)明的主題還是通過上述方法獲得或可獲得的植物細(xì)胞。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是通過上述在植物細(xì)胞中遺傳修飾的方法獲得或可獲得的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞。與原始植物細(xì)胞相比，這些植物細(xì)胞中的遺傳修飾例如可包括轉(zhuǎn)基因(優(yōu)選地為包含感興趣的基因的表達(dá)盒)的插入，至少一個(gè)核苷酸的取代，至少一個(gè)核苷酸的缺失，至少一個(gè)核苷酸的插入，dna甲基化的改變，組蛋白乙?；⒔M蛋白甲基化、組蛋白泛素化、組蛋白磷酸化、組蛋白sumo化、組蛋白核糖基化或組蛋白瓜氨酸化的改變，或其組合。優(yōu)選地，經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞不包含任何穩(wěn)定整合進(jìn)植物細(xì)胞基因組中的外源遺傳物質(zhì)。

112、經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞可以是整個(gè)植物的部分或其部分。因此，本發(fā)明還涉及包含上述經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞的植物或植物部分。

113、根據(jù)本發(fā)明的另一方面，經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞可以再生為完整(可育)植物。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選方面，在植物細(xì)胞的遺傳修飾之后是再生植物的步驟。因此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的植物的方法，包括以下步驟：

114、a)根據(jù)上述用于在植物細(xì)胞中遺傳修飾的方法對植物細(xì)胞遺傳修飾，和

115、b)從步驟a)的修飾的植物細(xì)胞再生植物，

116、優(yōu)選地，其中所產(chǎn)生的植物不包含在步驟a)中共同導(dǎo)入的任何基因組工程化組分、表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)或其活性衍生物(特別是dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑或組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci))、植物激素或其活性衍生物，或引起從愈傷組織或胚性組織的植物再生得以改善的蛋白質(zhì)或包含編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)盒。

117、如本文所用，“再生”是指單個(gè)或多個(gè)細(xì)胞增殖并發(fā)育成組織、器官以及最終整個(gè)植物的過程。

118、再生植物的步驟b)可以例如包含在再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)來自步驟a)的經(jīng)遺傳修飾的植物細(xì)胞。

119、再生技術(shù)依賴于組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中某些植物激素的處理，偶爾依賴于可以導(dǎo)入的抗微生物劑(biocide)和/或除草劑標(biāo)志物。再生可以得自植物體細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞或胚性細(xì)胞以及衍生自不同外植體(例如愈傷組織、未成熟或成熟的胚、葉、芽、根、花、小孢子、胚性組織、分生組織、器官或其任何部分)的原生質(zhì)體。此種再生技術(shù)在klee(1987)ann.rev.of?plant?phys.38:467486中有一般描述。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體的植物再生描述于evans等,protoplasts?isolation?and?culture,handbook?of?plant?cell?culture,pp.124-176,macmillilan?publishing?company,new?york,1983；和binding,regeneration?of?plants,plant?protoplasts,pp.21-73,crc?press,boca?raton,1985。要從轉(zhuǎn)化的或基因編輯的細(xì)胞中獲得完整的植物，可以在一系列含有營養(yǎng)和激素的介質(zhì)中在受控的環(huán)境條件下生長細(xì)胞，該過程稱為組織培養(yǎng)。一旦生成完整植物并產(chǎn)生種子，就開始評估后代。

120、本發(fā)明還提供通過上述產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的植物或其后代植物的方法獲得或可獲得的經(jīng)遺傳修飾的植物。

121、本發(fā)明的另一主題是衍生自上述經(jīng)遺傳修飾的植物的植物細(xì)胞或種子。這種植物細(xì)胞或種子不包含任何基因組工程化組分、表觀遺傳調(diào)控化學(xué)物質(zhì)或其活性衍生物(特別是組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci))、植物激素或其活性衍生物、以及引起從愈傷組織或胚性組織的植物再生得以改善的蛋白質(zhì)或包含編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)盒

122、本發(fā)明的另一主題是無需基于標(biāo)志物基因的選擇的衍生自上述經(jīng)遺傳修飾的細(xì)胞的植物、植物細(xì)胞或種子。如本文所用，“基于標(biāo)志物基因的選擇”是指通過使用整合的選擇標(biāo)志物(基因)，例如抗生素抗性基因(例如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因)或除草劑抗性基因(例如膦絲菌素抗性基因、草甘膦抗性基因)從野生型細(xì)胞中選擇，鑒定和/或純化修飾的細(xì)胞，特別是轉(zhuǎn)化的、基因編輯的或堿基編輯的細(xì)胞的任何過程。沒有這樣的選擇，這種植物、植物細(xì)胞或種子可能不具有任何整合的基因組工程化組分，并從而可能導(dǎo)致無轉(zhuǎn)基因的經(jīng)遺傳修飾的植物或僅整合了感興趣的轉(zhuǎn)基因的修飾的植物。

123、本發(fā)明的另一個(gè)方面是表觀遺傳學(xué)調(diào)控化學(xué)物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)脫乙?；敢种苿┗蚱浠钚匝苌?，特別是組蛋白脫乙?；敢种苿?hdaci))、和/或植物激素或其活性衍生物，和/或引起從體細(xì)胞、愈傷組織細(xì)胞或胚性細(xì)胞的植物再生得以改善的蛋白質(zhì)或包含編碼所述蛋白質(zhì)的核酸的表達(dá)盒用于提高在植物細(xì)胞中遺傳修飾的效率的用途，優(yōu)選地在本文上述方法中。

124、除非在實(shí)施例中另有說明，否則所有重組dna技術(shù)均根據(jù)如在以下中所述的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行：sambrook等(1989)，(1989)molecular?cloning:alaboratory?manual,secondedition,cold?spring?harbor?laboratory?press,ny；以及ausubel等(1994)，currentprotocols?in?molecular?biology,current?protocols,usa的第1卷和第2卷。biosscientific?publications(uk)和blackwell?scientific?publications,uk聯(lián)合出版的r.d.d.cray的plant?molecular?biology?labfax(1993)中描述了用于植物分子研究的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法。標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)的其他參考包括sambrook?and?russell(2001)molecular?cloning:a?laboratory?manual,third?edition,cold?spring?harborlaboratory?press,ny，brown(1998)molecular?biology?labfax,second?edition,academic?press(uk)的第i卷和第ii卷。用于聚合酶鏈反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法可參見dieffenbach和dveksler(1995)pcr?primer:a?laboratory?manual,cold?spring?harborlaboratory?press，以及mcpherson等，(2000)pcr-basics:from?background?to?bench,first?edition,springer?verlag,germany。

125、本文引用或援引的所有專利、專利申請和出版物或公共公開內(nèi)容(包括互聯(lián)網(wǎng)上的出版物)均通過引用以其全文并入本文。

126、通過以下附圖和實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。

127、附圖

128、圖1：plh-pat5077399-70subi-tdt構(gòu)建體圖譜。tdt定義tdtomato基因。

129、圖2：通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送15ng?tsa與構(gòu)建體plh-pat5077399-70subi-tdt(圖1)。

130、a：紅色熒光圖像顯示轟擊后16小時(shí)的玉米hi?ii未成熟胚中的表達(dá)tdtomato的細(xì)胞(白色斑點(diǎn))。上面的圖像是從沒有tsa(無tsa)的對照轟擊中拍攝的，而底部的圖像是從具有15ng的tsa的共同轟擊中拍攝的。

131、b：沒有tsa(無tsa)或具有15ng的tsa(15ng?tsa)的轟擊后16小時(shí)每個(gè)胚的紅色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。誤差線＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。

132、圖3：通過在玉米hi?ii未成熟胚中的100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送不同量的tsa(無tsa、15ng、30ng和45ng)與構(gòu)建體plh-pat5077399-70subi-tdt(圖1)。

133、a：用不同量的tsa轟擊后16小時(shí)在玉米hi?ii未成熟胚中每個(gè)視野的熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。

134、b：當(dāng)用不同量的tsa共同轟擊時(shí)，熒光細(xì)胞的平均數(shù)目的增加百分比。誤差線＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。

135、圖4：pgep359構(gòu)建體圖譜。tdt定義tdtomato基因。zmlpcpf1定義毛螺菌科細(xì)菌(lachnospiraceae?bacterium)crispr/cpf1(lbcpf1)基因的玉米密碼子優(yōu)化的cds。

136、圖5：通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊共同遞送15ng?tsa與構(gòu)建體pgep359(圖4)。

137、a：轟擊后16小時(shí)，紅色熒光圖像顯示玉米hi?ii?ii型愈傷組織中表達(dá)tdtomato的細(xì)胞。左邊的圖像是從沒有tsa(無tsa)的對照轟擊中拍攝的，而右邊的圖像是從具有15ngtsa的共同轟擊中拍攝的。

138、b：沒有(無tsa)或具有15ng的tsa的轟擊后16小時(shí)每個(gè)視野中紅色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。誤差線＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。

139、圖6：通過300μg金顆粒(0.6μm)的微彈轟擊來共同遞送15ng?tsa與構(gòu)建體plh-pat5077399-70subi-tdt(圖1)。

140、a：紅色熒光圖像顯示轟擊后24小時(shí)，甜菜松散型愈傷組織(friable?callus)中表達(dá)tdtomato的細(xì)胞(白色斑點(diǎn))。上面的圖像是從沒有tsa(無tsa)的對照轟擊中拍攝的，而底部的圖像則顯示具有15ng?tsa的共同轟擊。

141、b：在沒有(-tsa)或具有15ng?tsa(+tsa)的轟擊后24小時(shí)每個(gè)視野的熒光細(xì)胞平均數(shù)目。誤差線＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。

142、圖7：pgep284構(gòu)建體圖譜。tdt定義tdtomato基因。tacrispr定義crispr核酸酶的小麥密碼子優(yōu)化的cds。sggep14將向?qū)na靶標(biāo)定為玉米光澤2基因(maize?glossy?2gene)的第一外顯子。

143、圖8：通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送不同量的tsa(無tsa、15ng、30ng和45ng)與基因編輯構(gòu)建體pgep284(圖7)。a：共同轟擊后2天，hi?ii胚中位點(diǎn)特異性indel(插入和缺失)率。b：當(dāng)玉米hi?ii胚中不同量的tsa(無tsa、15ng、30ng和45ng，從左到右)與基因組編輯構(gòu)建體pgep284共同轟擊時(shí)，indel率的變化百分比。

144、圖9：pgep353構(gòu)建體圖譜。crgep46定義crrna46，其靶向玉米甘油酸激酶基因(glyk)。

145、圖10：基因編輯構(gòu)建體pgep359(zmlbcpf1，圖4)和pgep353(crrna46，圖9)與15ngtsa(右側(cè)，15ng?tsa)或無tsa(左側(cè)，無tsa)共同傳遞進(jìn)玉米hi?ii愈傷組織。

146、圖11：pgep362構(gòu)建體圖譜。mneongreen定義mneongreen基因，其編碼最亮的單體綠色或黃色熒光蛋白，激發(fā)最大值為506nm且發(fā)射最大值為517nm。zmlpcpf1定義毛螺菌科細(xì)菌crispr/cpf1(lbcpf1)基因的玉米密碼子優(yōu)化的cds。

147、圖12：通過微彈轟擊將250ng?2,4-d與構(gòu)建體pgep362(圖11)共同遞送至玉米hiii未成熟胚中。

148、a：綠色熒光圖像顯示轟擊后16小時(shí)，在玉米hi?ii未成熟胚中表達(dá)mneongreen報(bào)告基因的細(xì)胞。上面的圖像是從沒有2,4-d(無2,4-d)的對照轟擊中拍攝的，而底部的圖像則顯示了具有250ng?2,4-d的共同轟擊。

149、b：轟擊后16小時(shí)每個(gè)胚的綠色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。誤差線＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。

150、圖13：通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送不同量的2,4-d(0ng、125ng、250ng和500ng)與構(gòu)建體pgep362(圖11)。

151、a：綠色熒光圖像顯示與不同量的2,4-d(0ng、125ng、250ng和500ng)共同轟擊后16小時(shí)，玉米hi?ii?ii型愈傷組織細(xì)胞中表達(dá)mneongreen報(bào)告基因的細(xì)胞。

152、b：用不同量的2,4-d(0ng、125ng、250ng和500ng)轟擊后16小時(shí)，每個(gè)視野的綠色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。誤差線＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。

153、圖14：通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊將2,4-d與構(gòu)建體pgep359(圖4)共同遞送至玉米植物的葉中(上面：無2,4-d，底部：具有250ng的2,4-d)(示例性tdt表達(dá)由箭頭指示)。

154、圖15：通過與100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊，將250ng?6-ba或玉米素與構(gòu)建體pgep359(圖4)共同遞送至玉米hi?ii?ii型愈傷組織中。

155、a：在沒有激素(無激素)、具有250ng?6-ba或具有250ng玉米素的轟擊后16小時(shí)，從左到右的紅色熒光圖像顯示玉米hi?ii?ii型愈傷組織細(xì)胞中表達(dá)tdtomato報(bào)告基因的細(xì)胞。

156、b：轟擊后16小時(shí)每個(gè)視野中紅色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。誤差線＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。

157、圖16：pabm-bdef1_zmplt5構(gòu)建體圖譜。玉米plt5基因(zmplt5)由來自短柄草屬(brachypodium)的強(qiáng)組成型ef1啟動子(bdef1)驅(qū)動。

158、圖17：pabm-bdef1_zmplt7構(gòu)建體圖譜。玉米plt7基因(zmplt7)由來自短柄草屬的強(qiáng)組成型ef1啟動子(bdef1)驅(qū)動。

159、圖18：pabm-bdef1_tarkd構(gòu)建體圖譜。小麥rkd基因(tarkd)由來自短柄草屬的強(qiáng)組成型ef1啟動子(bdef1)驅(qū)動。

160、圖19：通過用100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊，將100ng加強(qiáng)基因構(gòu)建體與構(gòu)建體pgep359(圖4)共同遞送到玉米hi?ii未成熟胚中。

161、a：紅色熒光圖像顯示轟擊后16小時(shí)，在玉米hi?ii未成熟胚中表達(dá)tdtomato報(bào)告基因的細(xì)胞。左到右的圖像是從沒有加強(qiáng)(僅tdt)的對照轟擊或具有zmplt5(圖16)(tdt+zmplt5)或小麥rkd(tarkd，圖18)(tdt+tarkd)加強(qiáng)構(gòu)建體的轟擊中拍攝的。

162、b：轟擊后16小時(shí)，每個(gè)胚的紅色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。誤差線＝標(biāo)準(zhǔn)偏差。

163、圖20：與zmplt5或zmplt7基因構(gòu)建體共同轟擊后12天，觀察到tdtomato熒光胚胎發(fā)生的愈傷組織。圖中所顯示的紅色熒光圖像顯示在轟擊后12天，在從未成熟胚誘導(dǎo)的胚胎發(fā)生的愈傷組織細(xì)胞中表達(dá)的tdtomato報(bào)告基因。從左至右的圖像顯示僅用tdtomato報(bào)告基因(僅tdt)或用100ng的加強(qiáng)zmplt5(tdt+zmplt5)或zmplt7基因構(gòu)建體(tdt+zmplt7)轟擊的胚。

164、圖21：tdtomato與小麥rkd加強(qiáng)構(gòu)建體共同轟擊后17天，在a188未成熟胚中誘導(dǎo)愈傷組織。

165、a：明場圖像顯示從僅用tdtomato報(bào)告構(gòu)建體轟擊的未成熟胚中誘導(dǎo)愈傷組織。

166、b：明場圖像顯示了從用tdtomato報(bào)告和小麥rkd構(gòu)建體共同轟擊的未成熟胚中誘導(dǎo)愈傷組織。

167、實(shí)施例

168、實(shí)施例1：沒有曲古抑菌素a(tsa)預(yù)處理的玉米未成熟胚中，通過微彈轟擊將tsa與含有tdtomato報(bào)告基因(即plh-pat5077399-70subi-tdt)的構(gòu)建體的共同遞送提高了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率。

169、過程：制備用于轟擊的玉米未成熟胚：授粉后8-10天，收獲具有0.8至1.8mm大小的未成熟胚的玉米穗(即a188或hi?ii)。穗用70％乙醇消毒10-15分鐘。在層流罩(laminarhood)中短暫風(fēng)干后，用鯊魚解剖刀從穗上除去上部～1/3的玉米粒，并用刮刀小心地將未成熟的胚從玉米粒中取出。將新鮮的分離的胚置于胚子葉面朝上的滲透培養(yǎng)平板(見下文)中的轟擊靶區(qū)域上。轟擊前，用石蠟?zāi)ぐ桨宀⑵湓?5℃黑暗中孵育4-20小時(shí)。

170、用于用100μg金顆粒(約4.0-5.0x?107?0.6微米金顆粒)轟擊的tsa量為0.01ng至500ng的范圍，優(yōu)選為0.1至50ng的范圍。將質(zhì)粒dna和tsa共同包被到用于轟擊的金顆粒上：對于10次發(fā)射，將總體積為100微升(μl)的50％(v/v)甘油中的1mg大小為0.6微米(μm)的金顆粒(每次發(fā)射100μg金顆粒)吸移到透明的低滯留微離心管中。超聲15秒鐘使金顆粒懸浮。在低速渦旋下，向每100μl金顆粒中按順序添加以下：

171、-多至10μl的dna(1.0μg總dna，每次發(fā)射100ng)

172、-100μl的2.5m?cacl2(在冰上預(yù)冷)

173、-40μl的0.1m冷亞精胺

174、蓋上蓋子并在0-10℃渦旋離心管2-30分鐘，并旋轉(zhuǎn)降下dna包被的金顆粒。用500μl?100％乙醇洗滌兩次后，將沉淀重懸于120μl的100％乙醇中。最后，將適量的tsa(對于100μg大小為0.6μm的金顆粒的轟擊，tsa的量為0.01至500ng，優(yōu)選為0.1-50ng；將tsa溶解在dmso中)小心添加到重懸的金顆粒中。低速渦旋時(shí)，將10μl的質(zhì)粒dna(plh-pat5077399-70subi-tdt構(gòu)建體；圖1)和tsa共同包被的金顆粒從管中以寬口的20μl吸頭平均地吸移到大載體的中心，由于此時(shí)顆粒傾向于形成團(tuán)塊，因此盡快將金顆粒置于大載體上?？諝飧稍?。

175、使用bio-rad?pds-1000/he粒子槍進(jìn)行轟擊。轟擊條件是：27-28mm/hg真空，450或650psi破裂片，6mm的間隙距離，樣品平臺在距腔室底部60mm距離的第二位置。轟擊后，將胚在滲透培養(yǎng)基上再保留16小時(shí)，并然后移至ii型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基平板上(見下文)。轟擊后16-48小時(shí)，使用熒光顯微鏡在激發(fā)最大值554nm和發(fā)射最大值581nm處針對tdtomato基因表達(dá)檢查瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。

176、ii型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：n6鹽、n6維生素、1.0mg/l的2,4-d、100mg/l的酪蛋白、2.9g/l的l-脯氨酸、20g/l的蔗糖、5g/l的葡萄糖、5mg/l的agno3、8g/l的細(xì)菌瓊脂(bacto-agar)、ph5.8。

177、滲透培養(yǎng)基：n6維生素、1.0mg/l的2,4-d、100mg/l的酪蛋白、0.7g/l的l-脯氨酸、0.2m的甘露醇(36.4g/l)、0.2m的山梨糖醇(36.4g/l)、20g/l蔗糖、15g/l細(xì)菌瓊脂、ph5.8。

178、在圖2中，通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送15ng?tsa與構(gòu)建體plh-pat5077399-70subi-tdt(圖1)改善玉米hi?ii未成熟胚中的dna瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在圖2a中，與未用tsa的對照轟擊相比，紅色熒光圖像顯示用15ng?tsa轟擊后16小時(shí)在玉米hi?ii未成熟胚中表達(dá)tdtomato的細(xì)胞。通過共同遞送15ng?tsa，轟擊后16小時(shí)每個(gè)胚的紅色熒光細(xì)胞(即陽性瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)的平均數(shù)目提高了98.2％(圖2b)。

179、已使用不同量的tsa-無tsa、15ng?tsa、30ng?tsa和45ng?tsa重復(fù)了此共同遞送實(shí)驗(yàn)(圖3)。tsa的存在總是改善玉米hi?ii未成熟胚中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在16小時(shí)的玉米hi?ii未成熟胚中每個(gè)視野的熒光細(xì)胞(即陽性瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)的平均數(shù)目在30ng的tsa左右顯示出最佳值(圖3a)。然而，甚至更低以及更高的濃度導(dǎo)致瞬時(shí)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的顯著增加(圖3b)。

180、實(shí)施例2：在沒有曲古抑菌素a(tsa)預(yù)處理的ii型玉米愈傷組織中，通過微彈轟擊的tsa與tdtomato報(bào)告構(gòu)建體pgep359(圖4)的共同遞送促進(jìn)了轉(zhuǎn)化效率

181、ii型愈傷組織誘導(dǎo)和選擇：如實(shí)施例1中所述，分離出大小為0.8-1.8mm的hi?ii未成熟胚，并立即將其胚子葉面朝上放置在ii型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(見下文)上，密度為每平板(直徑為100毫米)10-15個(gè)胚。用石蠟?zāi)ぐ桨?，并在黑暗中?7℃在平板中培養(yǎng)胚直到ii型愈傷組織出現(xiàn)(～2周)。在立體鏡下挑選松散型ii型愈傷組織，并將其移至ii型愈傷組織選擇培養(yǎng)基上(見下文)。重復(fù)此過程2-3次，并在誘導(dǎo)后4周丟棄胚。基于松散性(高度松散型)、形態(tài)(無胚樣結(jié)構(gòu))、顏色(新鮮、白色、半透明)，在立體鏡下仔細(xì)選擇ii型愈傷組織的胚前階段。每1-2周在愈傷組織選擇培養(yǎng)基中選擇并繼代培養(yǎng)ii型愈傷組織(見下文)，直到愈傷組織系穩(wěn)定(約3-5輪選擇)。每1-2周在ii型愈傷組織繼代培養(yǎng)基(見下文)中培養(yǎng)穩(wěn)定的ii型愈傷組織系。

182、用于轟擊的ii型愈傷組織的制備：在胚前階段選擇高度松散型ii型愈傷組織并將其轉(zhuǎn)移到滲透培養(yǎng)基平板中的轟擊靶區(qū)域(見實(shí)施例1)(單層、無重疊)。轟擊前，用石蠟?zāi)ぐ桨宀⒃诤诎抵杏?5℃孵育4-20小時(shí)(優(yōu)選的4小時(shí))。

183、使用與實(shí)施例1中所述相同的過程進(jìn)行微彈轟擊和轟擊后處理。

184、ii型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：n6鹽、n6維生素、1.0mg/l的2,4-d、100mg/l的酪蛋白、2.9g/l的l-脯氨酸、20g/l的蔗糖、5g/l的葡萄糖、5mg/l的agno3、8g/l的細(xì)菌瓊脂、ph5.8

185、ii型愈傷組織選擇培養(yǎng)基：n6鹽、n6維生素、1.0mg/l的2,4-d、100mg/l的酪蛋白、2.9g/l的l-脯氨酸、20g/l的蔗糖、2mg/l的agno3、8g/l的細(xì)菌瓊脂、ph5.8

186、ii型愈傷組織亞培養(yǎng)基：n6鹽，n6維生素，1.0mg/l的2,4-d，100mg/l的酪蛋白，0.7g/l的l-脯氨酸，20g/l的蔗糖，8g/l的細(xì)菌瓊脂，ph5.8

187、在圖5中，通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送15ng?tsa與構(gòu)建體pgep359提高了玉米hi?ii?ii型愈傷組織中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在圖5a中，紅色熒光圖像顯示與沒有tsa的對照轟擊相比，用15ng?tsa轟擊后16小時(shí)玉米hi?ii?ii型愈傷組織中表達(dá)tdtomato的細(xì)胞。通過共同遞送15ng?tsa，轟擊后16小時(shí)的玉米hi?ii?ii型愈傷組織中每個(gè)視野的熒光細(xì)胞(即陽性瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)的平均數(shù)目提高了43.3％(圖5b)。

188、實(shí)施例3：通過微彈轟擊的曲古抑菌素a(tsa)與構(gòu)建體plh-pat5077399-70subi-tdt的共同遞送改善了甜菜松散型愈傷組織的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。

189、甜菜愈傷組織誘導(dǎo)：將在芽培養(yǎng)基中(見下文)來自體外培養(yǎng)的甜菜芽的幼葉在層流罩中切成小塊(正方形，大小3-5mm)，并放在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(見下文)上，密度為每平板(直徑100毫米)10-15塊，近軸面朝上。用石蠟?zāi)ぐ桨宀⒃诤诎抵杏?3℃在平板上培養(yǎng)葉段6-8周直到愈傷組織出現(xiàn)。

190、制備用于轟擊的甜菜愈傷組織：在立體鏡下收獲松散型新鮮愈傷組織，并將它們轉(zhuǎn)移到甜菜滲透培養(yǎng)基中的轟擊靶區(qū)域(見下文)(單層，無重疊)。轟擊前，用石蠟?zāi)ぐ桨宀⒃诤诎抵杏?5℃孵育4-20小時(shí)。

191、使用實(shí)施例1中描述的相同過程進(jìn)行微彈轟擊和轟擊后處理，除了用于轟擊的金顆粒的量為300μg。

192、甜菜芽培養(yǎng)基：ms、0.25mg/l的bap、30g/l的蔗糖、8g/l的植物瓊脂、ph6.0

193、甜菜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：ms、2.0mg/l的bap、15g/l的蔗糖、8g/l的植物瓊脂、ph6.0

194、甜菜愈傷組織滲透培養(yǎng)基：ms、2.0mg/l的bap、15g/l的蔗糖、0.2m的甘露醇(36.4g/l)、0.2m的山梨糖醇(36.4g/l)、8g/l的植物瓊脂、ph6.0

195、在圖6中，通過300μg金顆粒(0.6μm)的微彈轟擊來共同遞送15ng?tsa與構(gòu)建體plh-pat5077399-70subi-tdt(圖1)改善了甜菜松散型愈傷組織中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在圖6a中，紅色熒光圖像顯示與沒有tsa的對照轟擊相比，用15ng?tsa轟擊后24小時(shí)在甜菜松散型愈傷組織中表達(dá)tdtomato的細(xì)胞。通過共同遞送15ng?tsa，轟擊后24小時(shí)每個(gè)視野的熒光細(xì)胞(即陽性瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞)的平均數(shù)目提高了193.7％(圖6b)。

196、實(shí)施例4：曲古抑菌素a(tsa)與基因編輯構(gòu)建體的共同遞送改善了玉米未成熟胚中的基因組編輯效率。

197、使用與實(shí)施例1中所述相同的過程進(jìn)行胚分離、微彈轟擊和轟擊后處理。

198、轟擊后兩天，收獲胚并使用來自qiagen(venlo,netherlands)的plant?dnaisolation?kit用于基因組dna分離。ngs(下一代測序)由illumina?inc.(san?diego,california,usa)的miseq平臺進(jìn)行。通過crispresso(http://crispresso.rocks/)的工具分析indel(插入和缺失)率。

199、在圖8中，與tsa(從左到右分別為無tsa、15ng、30ng和45ng)的共同轟擊導(dǎo)致轟擊后2天hi?ii胚中的基因編輯效率的改善。在圖8a中，顯示了針對不同量的tsa與基因編輯構(gòu)建體pgep284(圖7)共同轟擊后2天的hi?ii胚中的位點(diǎn)特異性indel率，其中位點(diǎn)特異性indel率指示基因編輯效率。tsa的存在總是提高玉米hi?ii未成熟胚中基因編輯事件的頻率。indel事件(即基因編輯陽性的胚)率顯示出在30ng的tsa左右的最佳值。但是，與沒有tsa相比，甚至更低以及更高的濃度會導(dǎo)致indel率顯著提高。當(dāng)不同量的tsa與基因編輯構(gòu)建體pgep284在玉米hi?ii胚中共同轟擊時(shí)，indel率的變化百分比如圖8b所示。

200、實(shí)施例5：曲古抑菌素a(tsa)與基因編輯構(gòu)建體pgep359(圖4)和pgep353(圖9)的共同遞送提高了玉米hi?ii?ii型愈傷組織中的基因組編輯效率

201、使用與實(shí)施例2中所述相同的過程進(jìn)行ii型愈傷組織培養(yǎng)和微彈轟擊以及轟擊后處理。

202、轟擊后2-15天，收獲胚并使用來自qiagen的plant?dna?isolation?kit用于基因組dna分離。ngs(下一代測序)由illumina?miseq平臺進(jìn)行。通過crispresso的工具分析indel(插入和缺失)率。

203、在圖10中，基因編輯構(gòu)建體pgep359(zmlbcpf1，圖4)和pgep353(crrna46，圖9)與15ng?tsa(在右側(cè)，15ng的tsa)或無tsa(在左側(cè)，無tsa)在玉米hi?ii愈傷組織中的共同轟擊顯示了共同轟擊后13天，位點(diǎn)特異性indel(插入和缺失)率提高為6.75倍或提高了575％。

204、實(shí)施例6：通過微彈轟擊的生長素2,4-d與mneongreen報(bào)告構(gòu)建體pgep362(圖11)的共同遞送提高了其在玉米未成熟胚中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率

205、采用與實(shí)施例1中所述相同的過程進(jìn)行胚分離和微彈轟擊以及轟擊后處理。

206、用于用100μg金顆粒(約4.0?-5.0x?107的0.6μm金顆粒)轟擊的2,4-d的量在1.0ng至1000ng的范圍，優(yōu)選10ng至500ng的范圍。如實(shí)施例1所述進(jìn)行質(zhì)粒dna和2,4-d共包被到用于轟擊的金顆粒上。在100％dmso中制備2,4-d儲備溶液(例如1mg/ml)。

207、在圖12中，通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送250ng?2,4-d與構(gòu)建體pgep362(圖11)改善了玉米hi?ii未成熟胚中的dna瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。在圖12a中，綠色熒光圖像顯示了轟擊后16小時(shí)的玉米hi?ii未成熟胚中表達(dá)mneongreen報(bào)告基因的細(xì)胞。b：與無2,4-d的對照轟擊相比，用250ng的2,4-d轟擊后16小時(shí)每個(gè)視野的綠色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。與250ng的2,4-d的共同轟擊導(dǎo)致每個(gè)胚的熒光細(xì)胞平均數(shù)目增加187％(圖12b)。

208、實(shí)施例7：通過微彈轟擊的生長素2,4-d與mneongreen報(bào)告構(gòu)建體pgep362(圖11)的共同遞送提高了其在玉米hi?ii?ii型愈傷組織中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率

209、使用與實(shí)施例2中所述相同的過程進(jìn)行ii型愈傷組織培養(yǎng)和微彈轟擊以及轟擊后處理。

210、用于用100μg金顆粒(約4.0?-5.0x?107的0.6μm金顆粒)轟擊的2,4-d的量在1.0ng至1000ng的范圍，優(yōu)選10ng至500ng的范圍。如實(shí)施例6所述進(jìn)行質(zhì)粒dna和2,4-d共同包被到用于轟擊的金顆粒上。

211、在圖13中，通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送不同量的2,4-d(0ng、125ng、250ng和500ng)與構(gòu)建體pgep362(圖11)改善了玉米hi?ii?ii型愈傷組織的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。綠色熒光圖像顯示用不同量的2,4-d(從左上到右下：2,4-d?0ng、125ng、250ng和500ng)共同轟擊后16小時(shí)玉米hi?ii?ii型愈傷組織細(xì)胞中表達(dá)mneongreen報(bào)告基因的細(xì)胞，其顯示用2,4-d的共同轟擊使熒光顯著增加(圖13a)。在圖13b中，顯示出了在用不同量的2,4-d(0ng、125ng、250ng和500ng)轟擊之后16小時(shí)，每個(gè)視野綠色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。通過添加2,4-d，熒光細(xì)胞的平均數(shù)目已經(jīng)提高至少34.8％。

212、實(shí)施例8：通過微彈轟擊的生長素2,4-d與tdtomato報(bào)告構(gòu)建體pgep359(圖4)的共同遞送提高了其在玉米植物葉中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率

213、玉米植物已經(jīng)在溫室中生長。使用bio-rad?pds-1000/he粒子槍在階段v8中進(jìn)行了微彈轟擊。轟擊條件是：27-28mm/hg真空，450或650psi破裂片，6mm的間隙距離。轟擊后20小時(shí)，使用熒光顯微鏡在激發(fā)最大值554nm和發(fā)射最大值581nm處針對tdtomato基因表達(dá)檢查瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。如實(shí)施例1中所述將質(zhì)粒dna和2,4-d共同包被到用于轟擊的金顆粒上。2,4-d儲備溶液(例如在dmso中為25mg/ml)。

214、在圖14中，通過微彈轟擊共同遞送2,4-d與構(gòu)建體pgep359(圖4)改善了玉米葉中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。

215、實(shí)施例9：通過微彈轟擊的細(xì)胞分裂素如6-ba或玉米素與tdtomato報(bào)道構(gòu)建體pgep359(圖4)的共同遞送提高了其在玉米hi?ii?ii型愈傷組織中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率

216、使用與實(shí)施例2中所述相同的過程進(jìn)行ii型愈傷組織培養(yǎng)和微彈轟擊以及轟擊后處理。

217、用于用100μg金顆粒(約4.0?-5.0x?107的0.6μm金顆粒)轟擊的6-ba或玉米素的量在1.0ng至1000ng的范圍，優(yōu)選10ng至1000ng的范圍。如實(shí)施例6所述進(jìn)行質(zhì)粒dna和細(xì)胞分裂素共同包被到用于轟擊的金顆粒。

218、在圖15中，通過用100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊，在玉米hi?ii?ii型愈傷組織中的250ng?6-ba或玉米素與構(gòu)建體pgep359(圖4)的共同遞送。轟擊后16小時(shí)(圖15a)，紅色熒光圖像顯示玉米hi?ii?ii型愈傷組織細(xì)胞中的表達(dá)tdtomato報(bào)告基因的細(xì)胞，從左到右：沒有激素的對照轟擊(無激素)、用250ng的6-ba的轟擊和用250ng的玉米素的轟擊。在圖15b中，顯示了轟擊后16小時(shí)每個(gè)視野紅色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。250ng?6-ba共同轟擊使熒光細(xì)胞的平均數(shù)目提高了35.8％，且250ng玉米素共同轟擊使熒光細(xì)胞的平均數(shù)目提高了31.2％。

219、實(shí)施例10：通過微彈轟擊的加強(qiáng)基因與tdtomato報(bào)告構(gòu)建體(圖4)的共同遞送提高了其在玉米未成熟胚中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率

220、使用與實(shí)施例1中所述相同的過程進(jìn)行胚分離、微彈轟擊和轟擊后處理。

221、加強(qiáng)基因與熒光報(bào)告構(gòu)建體(tdtomato基因，圖4)共同轟擊。用于用100μg金顆粒(約4.0?-5.0x?107的0.6μm的金顆粒)和100ng的tdtomato報(bào)告構(gòu)建體進(jìn)行轟擊的加強(qiáng)基因構(gòu)建體(圖16，圖17，圖18)的量為10.0ng至1000ng的范圍，優(yōu)選50ng至100ng的范圍。如實(shí)施例1所述進(jìn)行質(zhì)粒dna包被在用于轟擊的金顆粒上。

222、通過轟擊玉米hi?ii未成熟胚后16-20的其提高報(bào)告基因的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化頻率的能力來測量加強(qiáng)作用。

223、通過100μg金顆粒(0.6μm大小)的微彈轟擊來共同遞送100ng加強(qiáng)基因構(gòu)建體與100ng的tdtomato報(bào)告構(gòu)建體(圖4)改善了玉米hi?ii未成熟胚中的tdtomato基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。

224、在圖19a中，紅色熒光圖像顯示轟擊后16小時(shí)的玉米hi?ii未成熟胚中的表達(dá)tdtomato報(bào)告基因的細(xì)胞。圖19b：與僅用報(bào)告(僅tdt)的對照轟擊相比，用加強(qiáng)基因構(gòu)建物轟擊后16小時(shí)每個(gè)胚的紅色熒光細(xì)胞的平均數(shù)目。用100ng的zmplt5加強(qiáng)基因構(gòu)建體(圖16)(tdt+zmplt5)的共同轟擊導(dǎo)致每個(gè)胚的熒光細(xì)胞的平均數(shù)目提高了102％，或者與100ng的小麥rkd(tarkd)(圖18)(tdt+tarkd)的共同轟擊導(dǎo)致每個(gè)胚的熒光細(xì)胞的平均數(shù)目提高了144％(圖19b)。

225、實(shí)施例11：加強(qiáng)基因的瞬時(shí)過表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)化頻率(tf)

226、使用與實(shí)施例10中所述相同的過程進(jìn)行胚分離、微彈共同轟擊和轟擊后的處理。通過沒有選擇的轟擊玉米hi?ii未成熟胚(ie)后12天的其提高報(bào)告基因的轉(zhuǎn)化頻率的能力來測量對于轉(zhuǎn)化的加強(qiáng)作用。

227、如表1所示，tdtomato構(gòu)建體與zmplt5的共同轟擊導(dǎo)致tdtomato基因的轉(zhuǎn)化頻率的提高42.9％(與對照相比提高超過16倍)，而與zmplt7的共同轟擊使得沒有選擇的轟擊后12天的tdtomato基因的轉(zhuǎn)化頻率的提高53％(與對照相比提高超過16倍)(圖20)。

228、表1：轟擊后12天的tdt轉(zhuǎn)化頻率(ft)：ft被定義為自100個(gè)被轟擊的胚中具有至少一個(gè)表達(dá)tdt的胚胎發(fā)生結(jié)構(gòu)的胚的數(shù)目(tdt陽性ie的數(shù)目)。

229、 只tdt tdt+zmplt5 tdt+zmplt7 tdt陽性ie/總ie的數(shù)目 1/40 21/49 26/49 tdt?tf 2.5％ 42.9％ 53.1％

230、實(shí)施例12：小麥rkd加強(qiáng)基因(seq?id?no：6)的瞬時(shí)過表達(dá)促進(jìn)a188未成熟胚中的愈傷組織誘導(dǎo)

231、使用與實(shí)施例10中所述相同的過程進(jìn)行的胚分離、微彈共同轟擊和轟擊后處理，并且如實(shí)施例2中所述進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。

232、小麥rkd基因的瞬時(shí)過表達(dá)導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)的顯著改善，誘導(dǎo)率從沒有tarkd的38％提高到有100ng的tarkd的75％(幾乎是加倍了愈傷組織誘導(dǎo)率)(圖21)。