本發(fā)明屬于微藻，具體涉及一種通過異養(yǎng)發(fā)酵強化小球藻蛋白生產(chǎn)的方法。

背景技術(shù)：

1、微藻來源的單細胞小球藻因其具有生長速度快，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成合理等優(yōu)點，被認為是一種理想的優(yōu)質(zhì)蛋白源。目前，商業(yè)化小球藻生物質(zhì)來源主要通過傳統(tǒng)開放式跑道池進行培養(yǎng)，這種光自養(yǎng)培養(yǎng)模式受季節(jié)和培養(yǎng)環(huán)境條件等因素的限制，存在小球藻生物量濃度低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)成本高、生物質(zhì)產(chǎn)能低等缺陷。利用成熟可控的發(fā)酵設備進行異養(yǎng)培養(yǎng)，可以實現(xiàn)小球藻生物質(zhì)的穩(wěn)定高效生產(chǎn)，已被證明是一種更為經(jīng)濟和高效的小球藻生物質(zhì)生產(chǎn)途徑。蛋白含量和蛋白產(chǎn)量是評價小球藻蛋白生產(chǎn)的兩個重要指標。異養(yǎng)發(fā)酵下所能達到的小球藻蛋白含量水平?jīng)Q定了小球藻蛋白的品質(zhì)、價格和應用領(lǐng)域，商業(yè)化小球藻產(chǎn)品中蛋白含量一般要求大于50％以上；而蛋白產(chǎn)量的高低則決定了小球藻蛋白的生產(chǎn)成本和經(jīng)濟性。

2、但是在異養(yǎng)培養(yǎng)下，小球藻細胞通常會傾向地積累高含量的脂質(zhì)或碳水化合物(>50％)，而蛋白質(zhì)含量較低(<40％)，這極大地限制了異養(yǎng)小球藻生物質(zhì)作為蛋白源在食品和飼料領(lǐng)域中的應用?，F(xiàn)有文獻結(jié)果表明通過調(diào)控小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中的氮營養(yǎng)供應(提高氮濃度或降低碳氮比)可以提高小球藻胞內(nèi)蛋白含量。而且，培養(yǎng)基中氮源種類也影響蛋白含量和細胞生長，相比于硝態(tài)氮(no3-)和尿素態(tài)氮，相同摩爾濃度的銨態(tài)氮(nh4+)因其利用過程能量消耗最低，被認為更有利于小球藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累。例如，中國專利申請cn115161203b的現(xiàn)有技術(shù)即公開了采用兩階段培養(yǎng)模式提高異養(yǎng)發(fā)酵下小球藻蛋白產(chǎn)量。該方案將小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白過程分為生物質(zhì)生產(chǎn)和誘導蛋白生產(chǎn)兩個階段，生物質(zhì)生產(chǎn)階段以氯化銨作為氮源，采用高碳氮(c/n＝320-400：1)補料液進行補料，當細胞達到對數(shù)生長中后期后，以氯化銨或尿素作為氮源，切換補料培養(yǎng)基為低碳氮比(c/n＝3-12：1)補料培養(yǎng)基以實現(xiàn)蛋白質(zhì)誘導。實驗證明，使用氯化銨作為氮源在低c/n比誘導下同期蛋白含量比用尿素作為氮源時更高一些，但細胞生物量濃度因低c/n誘導條件下高銨對細胞的毒性作用而損失了一部分蛋白產(chǎn)量。而若在誘導階段使用尿素替代銨鹽時細胞濃度不會出現(xiàn)顯著下降，這有利于維持細胞濃度，但尿素作為氮源時小球藻胞內(nèi)蛋白含量的提升效果不及銨鹽。由于，蛋白產(chǎn)量＝細胞生物量(干重)×蛋白含量，因此最終蛋白產(chǎn)量與細胞生物量和蛋白含量的大小均直接相關(guān)。由此可見，在誘導蛋白生產(chǎn)階段無論是使用尿素還是銨作為氮源，都無法獲得蛋白產(chǎn)量的最大化。

3、為了解決使用銨態(tài)氮易導致細胞生物量下降和尿素對細胞蛋白含量提升效果較差等技術(shù)問題，發(fā)明人認為，對現(xiàn)有小球藻生產(chǎn)蛋白的培養(yǎng)技術(shù)提出改進方案是有必要的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、(一)要解決的技術(shù)問題

2、鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點、不足，本發(fā)明提供一種通過異養(yǎng)發(fā)酵強化小球藻蛋白生產(chǎn)的方法，主要通過在誘導小球藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)積累的階段，通過外源添加低濃度乙酸緩解高銨對小球藻細胞的細胞毒性，從而實現(xiàn)高銨培養(yǎng)下小球藻蛋白含量提升的同時維持細胞生物量不下降或少下降甚至繼續(xù)增長，達到提高小球藻的蛋白產(chǎn)量的目的，解決了現(xiàn)有技術(shù)高銨濃度抵御細胞生長及影響蛋白產(chǎn)量的問題，有利于降低小球藻蛋白的生產(chǎn)成本，提升經(jīng)濟性，為推動小球藻作為廉價高品質(zhì)蛋白源的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

3、(二)技術(shù)方案

4、第一方面，本發(fā)明提供一種通過異養(yǎng)發(fā)酵強化小球藻蛋白生產(chǎn)的方法，其包括：將小球藻種子液接種到發(fā)酵罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)，整個發(fā)酵過程中：培養(yǎng)溫度為22-30℃，培養(yǎng)過程中攪拌速度和溶解氧偶聯(lián)控制、溶解氧控制在5-80％，發(fā)酵培養(yǎng)液ph為6.0-7.0；所述發(fā)酵過程包括細胞生長和蛋白質(zhì)積累兩個階段；

5、細胞生長階段的發(fā)酵條件為：監(jiān)控發(fā)酵培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，當葡萄糖濃度降低到5g/l以下時，開始使用蠕動泵流加生長補料培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)，直到細胞干重達到200g/l及以上時，細胞生長階段結(jié)束并立即開始蛋白質(zhì)積累階段；

6、蛋白質(zhì)積累階段的發(fā)酵條件為：將細胞生長階段的所述生長補料培養(yǎng)基切換成誘導補料培養(yǎng)基繼續(xù)進行流加培養(yǎng)，同時向發(fā)酵罐中流加乙酸根溶液；培養(yǎng)過程中實時監(jiān)控葡萄糖濃度，根據(jù)葡萄糖濃度適時調(diào)節(jié)誘導補料培養(yǎng)基的流加速度，維持培養(yǎng)液中葡萄糖濃度在1-20g/l；同時監(jiān)控發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)液中乙酸根濃度，根據(jù)乙酸根濃度適時調(diào)節(jié)乙酸根溶液的流加速度，使乙酸根濃度為1-50mm；其中，誘導補料培養(yǎng)基的c/n小于生長補料培養(yǎng)基；

7、每隔2-24h進行一次取樣，當連續(xù)兩次取樣檢測發(fā)現(xiàn)細胞干重不變或者開始下降時結(jié)束培養(yǎng)并收獲。

8、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為改良endo培養(yǎng)基，所述生長補料培養(yǎng)基和誘導補料培養(yǎng)基均為濃縮的改良endo培養(yǎng)基；基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖，其濃度為25-35g/l，氮源為氯化銨，c/n比為9-24；生長補料培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖，其濃度為720-780g/l，氮源為氯化銨，c/n比為320-400:1；誘導補料培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖，其濃度為720-780g/l，氮源為氯化銨，c/n比為3-20:1。

9、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖含量為20g/l，nh4cl含量為1.5-4g/l；生長補料培養(yǎng)基中葡萄糖含量為750g/l，nh4cl含量為3.34-4.18g/l；誘導補料培養(yǎng)基中葡萄糖含量為750g/l，nh4cl含量為66.875-445.8g/l。

10、優(yōu)選地，在蛋白質(zhì)積累階段使發(fā)酵培養(yǎng)液中乙酸根濃度控制在5-50mm，優(yōu)選為5-10mm。

11、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述乙酸根溶液是乙酸、乙酸鹽或乙酸與乙酸鹽的混合物，所述乙酸鹽是乙酸鈉和乙酸鉀中至少一種；乙酸根溶液中乙酸根濃度為0.9-1.1m。

12、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，所述小球藻為野生型索羅金小球藻chlorellasorokiniana或蛋白表達增強的索羅金小球藻突變體。

13、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，在細胞生長和蛋白質(zhì)積累階段，保持發(fā)酵溫度為30℃，攪拌速度和溶解氧偶聯(lián)控制，溶解氧為20％。

14、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，在細胞生長和蛋白質(zhì)積累階段，使用氨水或2-4m的naoh溶液控制發(fā)酵培養(yǎng)液ph為6.0-7.0，優(yōu)選為6.5±0.2。

15、根據(jù)本發(fā)明的較佳實施例，在搖瓶中制備種子液，其制備過程如下：在無菌環(huán)境下，將經(jīng)搖瓶活化后的索羅金小球藻細胞以2-10％的體積百分比接種量接種于1000ml搖瓶中，搖瓶中培養(yǎng)液裝液量300-400ml，進行振蕩暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度22-30℃，轉(zhuǎn)速120-220rpm，培養(yǎng)時間2-5天；搖瓶培養(yǎng)基中碳源為葡萄糖，濃度為30g/l，氮源為kno3，濃度為2g/l。

16、本技術(shù)中，c/n是培養(yǎng)基中c原子和n原子的摩爾比。

17、(三)有益效果

18、(1)本發(fā)明采用異養(yǎng)發(fā)酵工藝培養(yǎng)小球藻以提高小球藻蛋白產(chǎn)量，在培養(yǎng)過程中全程使用銨態(tài)氮，有利于小球藻胞內(nèi)蛋白質(zhì)的積累；并將發(fā)酵過程包括細胞生長和蛋白質(zhì)積累兩個階段，在細胞生長階段使用高c/n比的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，期間采用高c/n的生長補料培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)，以將培養(yǎng)液中細胞干重提高到200g/l及以上，從而獲得高密度細胞培養(yǎng)液，這也為得到蛋白產(chǎn)量提供了大量的生物質(zhì)基數(shù)。在蛋白質(zhì)積累階段使用低c/n比的誘導補料培養(yǎng)基進行流加培養(yǎng)，該過程中同步流加低濃度乙酸根溶液，并控制乙酸根在蛋白質(zhì)積累階段的培養(yǎng)液中不超過50mm，用以抵御低c/n比誘導培養(yǎng)條件下高濃度銨對小球藻的細胞毒性，促進細胞藻細胞中蛋白質(zhì)的高效積累的同時維持細胞生物量不下降或少下降甚至繼續(xù)增長，最終達到顯著提高小球藻蛋白質(zhì)產(chǎn)量和含蛋白小球藻品質(zhì)的目的。本發(fā)明有利于降低小球藻蛋白的生產(chǎn)成本，提升經(jīng)濟性，為推動小球藻作為廉價高品質(zhì)蛋白源的規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

19、(2)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)低濃度乙酸(根)可以降低高銨脅迫培養(yǎng)下銨對小球藻細胞的毒性，使小球藻細胞能在高銨條件下顯著提升小球藻胞內(nèi)蛋白含量同時維持細胞生物量不下降或少下降甚至繼續(xù)增長，并最終實現(xiàn)蛋白含量和產(chǎn)量的同步提升。本發(fā)明的方案有望作為一種新的緩解銨毒性的方法應用于其他微藻高銨培養(yǎng)過程。