本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥,具體涉及一種神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物及其制備方法和其應(yīng)用。
背景技術(shù):
1、細胞是生命活動的基本單位和機體健康的基礎(chǔ)。當機體的氧化還原平衡遭到破壞時,會引起氧化還原信號和控制的中斷,引發(fā)氧化應(yīng)激損傷而引發(fā)多種疾病。腦部缺血缺氧(如腦卒中、腦溢血、長期高原作業(yè)、頸內(nèi)動脈及椎動脈閉塞和/或狹窄等)及氧化應(yīng)激損傷等,可引發(fā)多種因神經(jīng)元或膠質(zhì)細胞的丟失而導致的神經(jīng)退行性疾病,包括記憶力減退、阿爾茲海默癥、帕金森癥、老年癡呆、多發(fā)性硬化癥、共濟失調(diào)、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥等。目前,我國帕金森患者超過300萬,漸凍癥患者超過20萬,老年癡呆患者超過千萬,且隨著全球人口老年化的加劇而存在高發(fā)病率等特點。及時修復(fù)損傷細胞可以顯著改善、治療相關(guān)病變。
2、腦卒中(腦供血動脈狹窄或閉塞導致血液不能流入大腦)及腦溢血(腦部血管突然破裂)為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,因腦供血不足所致腦組織缺血缺氧性損傷,并表現(xiàn)出相應(yīng)神經(jīng)功能缺損癥狀,包括平衡問題、偏癱、感覺和振動感覺喪失、麻木、反射減弱、上瞼下垂、視野缺陷、失語和失用等,過量的自由基是早期急性缺血性卒中缺血再灌注損傷加重的主要原因,該病變具有發(fā)病率高、疾病預(yù)后差、易復(fù)發(fā)、致殘率高、死亡率高等特點,嚴重影響人類的健康和生存質(zhì)量。共濟失調(diào)多由小腦、本體感覺及前庭功能障礙導致的運動笨拙和不協(xié)調(diào),累及軀干、四肢和咽喉肌時可引起身體平衡、姿勢、步態(tài)及言語障礙,包括小腦性共濟失調(diào)、大腦性共濟失調(diào)、感覺性共濟失調(diào)、前庭性共濟失調(diào)等,病因復(fù)雜且常為多種疾病的綜合表現(xiàn),包括由梗死、水腫或出血導致的急性腦腫脹等。腦外傷多由外物造成的頭腦部外傷傷害,常引起不同程度的永久性功能障礙,包括運動、感覺、言語、視覺、聽覺等區(qū)域異常局灶性癥狀。周圍神經(jīng)損傷主要由創(chuàng)傷、腫瘤及代謝性疾病(如糖尿病及其并發(fā)癥)等因素引起的臨床常見病,經(jīng)常會導致機體受累節(jié)段運動、感覺和自主功能的部分或全部喪失,甚至出現(xiàn)頑固性神經(jīng)痛,嚴重影響患者的生活質(zhì)量。who于2017年發(fā)布《全球糖尿病報告》顯示,全球糖尿病患病人數(shù)呈現(xiàn)逐年增加趨勢。我國糖尿病患者1.29億,其多種并發(fā)癥(包括周圍神經(jīng)及末梢神經(jīng)缺血缺氧引起的神經(jīng)痛、神經(jīng)損傷等)導致糖尿病患者致殘致死等嚴重后果。
3、腦卒中的臨床治療在溶栓的同時強調(diào)腦神經(jīng)保護,以期逆轉(zhuǎn)神經(jīng)元凋亡并改善神經(jīng)損傷。丁苯酞可降低細胞內(nèi)鈣離子濃度,抑制谷氨酸釋放并減少花生四烯酸生成、清除氧自由基、提高氧化酶活性等,作用于腦缺血病變的多個病理環(huán)節(jié),臨床將其用于改善腦梗死病灶局部循環(huán),減小梗死面積,減輕腦組織損傷,恢復(fù)神經(jīng)功能,用于急性腦缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能缺損的改善,主要用于治療輕、中度急性缺血性腦卒中。依達拉奉右莰醇為抗氧化劑和自由基清除劑,可清除多種自由基,減輕腦水腫和組織損傷,抑制腦缺血再灌注導致的炎性因子表達而減少細胞凋亡和細胞壞死,臨床將其用于改善急性腦梗塞所致的神經(jīng)癥狀、日常生活活動能力和功能障礙等。
4、細胞及微生物受到外界刺激及外源應(yīng)激物(包括冷、熱、酸、堿、電流、輻射、化學物質(zhì)等)應(yīng)激誘導時會因應(yīng)激反應(yīng)而誘導細胞及微生物產(chǎn)生應(yīng)激蛋白。文獻1(newlimonophyllines?a-c?from?the?stem?of?atalantia?monophylla?and?cytotoxicityagainst?cholangiocarcinoma?and?hepg2?cell?lines,arch.pharm.res.(2018)41:431–437)公開了從蕓香科植物(atalantia?monophylla)提取制得的化合物1-16具有抑制腫瘤細胞生長等活性。
5、間充質(zhì)干細胞(mesenchymal?stem?cells,mscs)具有自我復(fù)制和多向分化潛能,廣泛存在于骨髓、脂肪、滑膜、牙髓、羊水、胎盤、臍帶、胚胎、臍帶血、羊膜、外周血、肌肉、尿液等組織,具有來源廣泛、無需配型、感染率低、分化潛能強、增殖能力強、采集方便等特點,可產(chǎn)生干細胞生長因子(scf)、神經(jīng)生長因子(ngf)、白介素-6(il-6)、白介素-7(il-7)、腫瘤壞死因子(tnf)、干擾素(ifn)等活性因子,參與調(diào)節(jié)細胞生長、細胞凋亡、細胞分化、抗病毒、免疫成熟等過程,可用于免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)及治療急性肺損傷、重癥肺炎、急性呼吸窘迫綜合征等疾病。但mscs產(chǎn)品需在其生產(chǎn)、儲運和應(yīng)用等環(huán)節(jié)采用冷藏方式,且其細胞活力保持≤12h,而限制其治療應(yīng)用。為此,需要開發(fā)安全有效的神經(jīng)修復(fù)藥物以滿足臨床需求。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物,其制備包括下述步驟:
2、(1)在本發(fā)明的細胞蛋白提取物中加入20u/ml-35u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一種或其組合,將其置于37℃±1℃條件下酶解15min-40min,制得酶解液;
3、(2)在2℃-8℃條件下,將步驟(1)制得的酶解液用洗脫溶劑配置成5-15mg/ml后,過色譜柱,洗脫流速為0.1-1ml/min,監(jiān)測并收集紫外波長為280nm的洗脫餾分,即得,其中,洗脫溶劑由50mmol/l磷酸鹽緩沖液(ph6.8)中含300mmol/l氯化鈉組成。
4、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述蛋白提取物的制備包括如下步驟:
5、s-1:將密度為5.0×106個/ml-1.0×107個/ml的間充質(zhì)傳代干細胞置于含有dmem/f12?40-50%、rpmi1640?40-50%、牛血清蛋白(bsa)0.1-2%、表皮細胞生長因子(egf)1-15ug/ml、成纖維細胞生長因子(fgf)1-15ug/ml、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白1-15ug/ml、復(fù)方氨基酸(18aa)0.01-0.1%和2-10μmol/l應(yīng)激物的培養(yǎng)基中,再將其置于37.0℃±0.5℃、5%±1.0%co2條件下培養(yǎng)2h-6h后,分離,洗滌,收集細胞,其中,所述的應(yīng)激物選自化合物1-16的任一種或其組合,
6、
7、
8、s-2:將收集細胞按照密度為5.0×106個/ml-5.0×107個/ml分散于溶劑中,再將其置于2℃-8℃條件下超聲處理,制得細胞裂解液,其中,所述溶劑選自選自生理鹽水、5%葡萄糖溶液、磷酸鹽緩沖液(pbs)、tbps緩沖液、tbst緩沖液、tris緩沖液的任一種或其組合;
9、s-3:將步驟s-2制得的細胞裂解液分離后,所得的分離液依次經(jīng)0.45um、0.22um濾膜過濾,即得。
10、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1的培養(yǎng)基中含有dmem/f1242-45%、rpmi164042-45%、牛血清蛋白(bsa)0.5-1.5%、表皮細胞生長因子(egf)5-10ug/ml、成纖維細胞生長因子(fgf)5-10ug/ml、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白5-10ug/ml、復(fù)方氨基酸(18aa)0.02-0.05%和3-8μmol/l的應(yīng)激物。
11、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1的培養(yǎng)基中含有dmem/f1245%、rpmi164045%、牛血清蛋白(bsa)0.5%、表皮細胞生長因子(egf)10ug/ml、成纖維細胞生長因子(fgf)10ug/ml,胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白10ug/ml、復(fù)方氨基酸(18aa)0.05%和4-6μmol/l的應(yīng)激物。
12、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1的間充質(zhì)傳代干細胞密度為8.0×106-2.0×107個/ml,優(yōu)選為8.0×106-1.0×107個/ml。
13、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1的間充質(zhì)傳代干細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h-5h,優(yōu)選為3.5h-4.5h。
14、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1中洗滌細胞的溶劑選自生理鹽水、5%葡萄糖溶液、磷酸鹽緩沖液(pbs)、tbps緩沖液、tbst緩沖液、tris緩沖液的任一種或其組合,細胞洗滌次數(shù)為2-5次,優(yōu)選為3-4次。
15、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1所述的分離選自離心、過濾的任一種或其組合,其中,所述離心條件為1000-2000rpm*3-15min,優(yōu)選為1200rpm-1500rpm*5-10min。
16、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-2的超聲條件為:在2℃-8℃、25khz、360w條件下工作3s再間隙1s,超聲處理1-5min。
17、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-3所述的分離選自2000-8000rpm*10-30min離心、多級離心、多級過濾的任一種或其組合,優(yōu)選為3000-7000rpm*15-25min。
18、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-3的多級離心依次為3000-4000rpm*3-5min、5000-6000rpm*3-5min和7000rpm*5-8min。
19、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述多級過濾的濾膜孔徑選自80um、50um、30um、10um、5um的任一種。
20、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,在s-3制得的細胞蛋白提取物中加入25u/ml-30u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一種或其組合,將其置于37℃±1℃條件下酶解20min-30min,制得酶解液。
21、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述核酸酶選自rna核酸酶、dna核酸酶的任一種或其組合。
22、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,將步驟s-3制得的細胞蛋白提取物或步驟(2)制得的蛋白組合物凍存,優(yōu)選凍存于-40℃至-20℃。
23、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,在步驟s-3制得的細胞蛋白提取物或步驟(2)制得的蛋白組合物中加入凍干保護劑,凍干,制得細胞蛋白提取物凍干制劑或蛋白組合物凍干制劑,其中,所述凍干保護劑選自甘露醇、山梨糖醇、右旋糖酐、甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯(hes)、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、山梨醇、淀粉中的任一種或其組合。
24、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,以質(zhì)量百分比計,所述凍干制劑中含有凍干保護劑0.5-8%,優(yōu)選為1-5%。
25、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,在在步驟s-3制得的細胞蛋白提取物或步驟(2)制得的蛋白組合物中任選地加入蛋白穩(wěn)定劑,其中,所述蛋白穩(wěn)定劑選自白蛋白、鋅鹽、鋁鹽的任一種。
26、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案,所述細胞蛋白提取物凍干制劑或蛋白組合物凍干制劑ph6-8,優(yōu)選為ph7-7.5。
27、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物的分子量為20kda-250kda,優(yōu)選為35kda-200kda。
28、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案,所述神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物中的蛋白組成如圖2所示。
29、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述凍干制劑臨用前用生理鹽水或5%葡萄糖溶液復(fù)溶后,采用靜脈注射、鞘內(nèi)注射、腰椎穿刺的任一種或其組合方式使用。
30、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述間充質(zhì)傳代干細胞的培養(yǎng)或原代間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)采用本領(lǐng)域的培養(yǎng)方法。
31、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述間充質(zhì)傳代干細胞的培養(yǎng)包括下述步驟:將原代間充質(zhì)干細胞按照初始密度為5.0×105-5.0×106個/ml加入到傳代培養(yǎng)基中,再將其置于37.0℃±0.5℃、5%±1.0%co2條件下培養(yǎng)10-15天,每隔2-3天,觀察傳代培養(yǎng)基變黃后,半量更換傳代培養(yǎng)基,其中,所述傳代培養(yǎng)基含有10%fbs、100u/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基。
32、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述原代間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)包括下述步驟:
33、1)將臍帶清洗消毒后,組織解剖,取華通膠層組織,將其切成3mm3的小塊,離心,清洗,收集組織塊,將其置于含10%胎牛血清fbs、100ug/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基中,再將其置于37.0℃±0.5℃、5%±1.0%co2條件下培養(yǎng),每間隔2-3天半量更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)至組織塊爬出細胞;
34、2)振搖,收集低層細胞用pbs清洗后,加入0.25%的胰蛋白酶消化2min-3min,加入等體積的胰蛋白酶終止液停止消化,吸管輕輕吹打,1200-1500rpm/min*5-8min離心后,收集細胞,即得。
35、本發(fā)明的目的在于提供一種具有神經(jīng)修復(fù)功效的細胞蛋白提取物的制備方法,包括如下步驟:
36、s-1:將密度為5.0×106個/ml-5.0×107個/ml的間充質(zhì)傳代干細胞置于含有dmem/f12?40-50%、rpmi1640?40-50%、牛血清蛋白(bsa)0.1-2%、表皮細胞生長因子(egf)1-15ug/ml、成纖維細胞生長因子(fgf)1-15ug/ml、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白1-15ug/ml、復(fù)方氨基酸(18aa)0.01-0.1%和2-10μmol/l應(yīng)激物的培養(yǎng)基中,再將其置于37.0℃±0.5℃、5%±1.0%co2條件下培養(yǎng)2h-6h后,分離,洗滌,收集細胞,其中,所述的應(yīng)激物選自化合物1-16的任一種或其組合;
37、s-2:將收集細胞按照密度為5.0×106個/ml-5.0×107個/ml分散于溶劑中,再將其置于2℃-8℃條件下超聲處理,制得細胞裂解液,其中,所述溶劑選自選自生理鹽水、5%葡萄糖溶液、磷酸鹽緩沖液(pbs)、tbps緩沖液、tbst緩沖液、tris緩沖液的任一種或其組合;
38、s-3:將步驟s-2制得的細胞裂解液分離后,所得的分離液依次經(jīng)0.45um、0.22um濾膜過濾,即得。
39、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1的培養(yǎng)基中含有dmem/f1242-45%、rpmi164042-45%、牛血清蛋白(bsa)0.5-1.5%、表皮細胞生長因子(egf)5-10ug/ml、成纖維細胞生長因子(fgf)5-10ug/ml、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白5-10ug/ml、復(fù)方氨基酸(18aa)0.02-0.05%和3-8μmol/l的應(yīng)激物。
40、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1的培養(yǎng)基中含有dmem/f1245%、rpmi164045%、牛血清蛋白(bsa)0.5%、表皮細胞生長因子(egf)10ug/ml、成纖維細胞生長因子(fgf)10ug/ml,胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白10ug/ml、復(fù)方氨基酸(18aa)0.05%和4-6μmol/l的應(yīng)激物。
41、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1的間充質(zhì)傳代干細胞密度為8.0×106-2.0×107個/ml,優(yōu)選為8.0×106-1.0×107個/ml。
42、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1的間充質(zhì)傳代干細胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)3h-5h,優(yōu)選為3.5h-4.5h。
43、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1中洗滌細胞的溶劑選自生理鹽水、5%葡萄糖溶液、磷酸鹽緩沖液(pbs)、tbps緩沖液、tbst緩沖液、tris緩沖液的任一種或其組合,細胞洗滌次數(shù)為2-5次,優(yōu)選為3-4次。
44、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-1所述的分離選自離心、過濾的任一種或其組合,其中,所述離心條件為1000-2000rpm*3-15min,優(yōu)選為1200rpm-1500rpm*5-10min。
45、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-2的超聲條件為:在2℃-8℃、25khz、360w條件下工作3s再間隙1s,超聲處理1-5min。
46、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-3所述分離選自2000-8000rpm*10-30min離心、多級離心、多級過濾的任一種或其組合,優(yōu)選為3000-7000rpm*15-25min。
47、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,步驟s-3的多級離心依次為3000-4000rpm*3-5min、5000-6000rpm*3-5min和7000rpm*5-8min。
48、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述多級過濾的濾膜孔徑選自80um、50um、30um、10um、5um的任一種。
49、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,將步驟s-3制得的細胞蛋白提取物凍存,優(yōu)選凍存于-40℃至-20℃。
50、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,將步驟s-3制得的細胞蛋白提取物采用核酸酶或全能核酸酶的任一種酶解后再分離純化。
51、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述間充質(zhì)傳代干細胞的培養(yǎng)或原代間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)采用本領(lǐng)域的培養(yǎng)方法。
52、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述間充質(zhì)傳代干細胞的培養(yǎng)包括下述步驟:將原代間充質(zhì)干細胞按照初始密度為5.0×105-5.0×106個/ml加入到傳代培養(yǎng)基中,再將其置于37.0℃±0.5℃、5%±1.0%co2條件下培養(yǎng)10-15天,每隔2-3天,觀察傳代培養(yǎng)基變黃后,半量更換傳代培養(yǎng)基,其中,所述傳代培養(yǎng)基含有10%fbs、100u/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基。
53、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述原代間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)包括下述步驟:
54、1)將臍帶清洗消毒后,組織解剖,取華通膠層組織,將其切成3mm3的小塊,離心,清洗,收集組織塊,將其置于含10%胎牛血清fbs、100ug/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的dmem/f12培養(yǎng)基中,再將其置于37.0℃±0.5℃、5%±1.0%co2條件下培養(yǎng),每間隔2-3天半量更換培養(yǎng)基,培養(yǎng)至組織塊爬出細胞;
55、2)振搖,收集低層細胞用pbs清洗后,加入0.25%的胰蛋白酶消化2min-3min,加入等體積的胰蛋白酶終止液停止消化,吸管輕輕吹打,1200-1500rpm/min*5-8min離心后,收集細胞,即得。
56、本發(fā)明的目的在于提供一種神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物的制備方法,包括如下步驟:
57、(1)在本發(fā)明的細胞蛋白提取物中加入20u/ml-35u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一種或其組合,將其置于37℃±1℃條件下酶解15min-40min,制得酶解液;
58、(2)在2℃-8℃條件下,將步驟(1)制得的酶解液用洗脫溶劑配置成5-15mg/ml后,過色譜柱,洗脫流速為0.1-1ml/min,監(jiān)測并收集紫外波長為280nm的洗脫餾分,即得,其中,洗脫溶劑由50mmol/l磷酸鹽緩沖液(ph6.8)中含300mmol/l氯化鈉組成。
59、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述核酸酶選自rna核酸酶、dna核酸酶的任一種或其組合。
60、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,在本發(fā)明的細胞蛋白提取物中加入25u/ml-30u/ml的核酸酶或全能核酸酶的任一種或其組合,將其置于37℃±1℃條件下酶解20min-30min,制得酶解液。
61、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物的分子量為20kda-250kda,優(yōu)選為35kda-200kda。
62、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,將步驟(2)所得蛋白組合物凍存,優(yōu)選凍存于-40℃至-20℃。
63、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,在步驟(2)收集的蛋白組合物中加入凍干保護劑,凍干,制得蛋白組合物凍干制劑,其中,所述凍干保護劑選自甘露醇、山梨糖醇、右旋糖酐、甘油、蔗糖、海藻糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、葡聚糖、三辛酸甘油酯(hes)、聚乙二醇、乙烯乙二烯、磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、山梨醇、淀粉中的任一種或其組合。
64、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,以質(zhì)量百分比計,所述凍干制劑中含有凍干保護劑0.5-8%,優(yōu)選為1-5%。
65、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,將步驟(2)收集的蛋白組合物中任選地加入蛋白穩(wěn)定劑,其中,所述蛋白穩(wěn)定劑選自白蛋白、鋅鹽、鋁鹽的任一種。
66、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案,所述凍干制劑ph6-8,優(yōu)選為ph7-7.5。
67、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案,所述神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物中的蛋白組成如圖2所示。
68、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述凍干制劑臨用前用生理鹽水或5%葡萄糖溶液復(fù)溶后,采用靜脈注射、鞘內(nèi)注射、腰椎穿刺的任一種或其組合方式使用。
69、本發(fā)明的另一目的在于提供一種神經(jīng)修復(fù)組合物,所述組合物由本發(fā)明的具有神經(jīng)功效的細胞蛋白提取物或神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物的任一種或其組合和藥學上可接受的載體組成。
70、本發(fā)明的藥學上可接受載體的用量或其種類根據(jù)組合物中有效成分的理化性質(zhì)和含量、制劑類型、制劑的溶出及生物利用度等因素而定。
71、本發(fā)明的組合物可為本領(lǐng)域的劑型,并可采用本領(lǐng)域的制劑技術(shù)制備得到。
72、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述組合物選自凍干劑、凝膠劑、鼻噴劑、液體敷料、注射劑、貼劑、膏劑、霜劑、乳劑、栓劑的任一種。
73、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述組合物的給藥方式選自靜脈注射、鞘內(nèi)注射、腰椎穿刺的任一種或其組合。
74、本發(fā)明的另一目的在于提供本發(fā)明具有神經(jīng)細胞修復(fù)功效的細胞蛋白提取物、神經(jīng)修復(fù)蛋白組合物或其組合物用于制備細胞修復(fù)、神經(jīng)修復(fù)的任一種的制品中的應(yīng)用。
75、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述神經(jīng)修復(fù)選自中樞神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病、腦卒中、腦外傷、共濟失調(diào)、腦溢血、阿爾茲海默癥、帕金森癥、老年癡呆、多發(fā)性硬化癥、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、周圍性神經(jīng)損傷、糖尿病、記憶力減退中的任一種病癥或其并發(fā)癥所致的神經(jīng)損傷。
76、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述共濟失調(diào)選自小腦性共濟失調(diào)、大腦性共濟失調(diào)、感覺性共濟失調(diào)、前庭性共濟失調(diào)的任一種或其并發(fā)癥。
77、本發(fā)明的另一目的在于提供化合物1-16用于應(yīng)激誘導干細胞產(chǎn)生具有修復(fù)功效的功能蛋白的應(yīng)用。
78、本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中,所述修復(fù)選自細胞修復(fù)、毛囊修復(fù)、關(guān)節(jié)修復(fù)、神經(jīng)修復(fù)中的任一種。
79、除非另有說明,本發(fā)明涉及液體與液體之間的百分比時,所述的百分比為體積/體積百分比;本發(fā)明涉及液體與固體之間的百分比時,所述百分比為體積/重量百分比;本發(fā)明涉及固體與液體之間的百分比時,所述百分比為重量/體積百分比;其余為重量/重量百分比。
80、除非另有說明,本發(fā)明間充質(zhì)干細胞mscs鑒定參照《standards?for?the?cultureand?quality?control?of?umbilical?cord?mesenchymal?stromal?cells?forneurorestorative?clinical?application》。
81、本發(fā)明采用商購試劑盒檢測活性氧(iod)、超氧化物歧化酶sod、丙二醛mda水平。
82、與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有下述有益效果:
83、1、本發(fā)明科學篩選含有應(yīng)激物的培養(yǎng)基應(yīng)激誘導間充質(zhì)干細胞產(chǎn)生具有細胞修復(fù)及神經(jīng)修復(fù)功效的功能蛋白,所得的細胞蛋白提取物、蛋白組合物或其組合物具有細胞修復(fù)及修復(fù)神經(jīng)損傷等功效,可用于修復(fù)中樞神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性疾病、腦卒中、腦外傷、共濟失調(diào)、腦溢血、阿爾茲海默癥、帕金森癥、老年癡呆、多發(fā)性硬化癥、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、周圍性神經(jīng)損傷、糖尿病、記憶力減退、小腦性共濟失調(diào)、大腦性共濟失調(diào)、感覺性共濟失調(diào)、前庭性共濟失調(diào)中的任一種病癥或其并發(fā)癥所致的神經(jīng)損傷,并具有純度高、穩(wěn)定性好、生物利用度高、安全有效、便于生產(chǎn)和儲運等優(yōu)點。
84、2、本發(fā)明的制備方法具有操作簡便,綠色環(huán)保,成本更優(yōu),適用于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。