本發(fā)明涉及預(yù)防用生物制品研發(fā)，尤其涉及一種水泡性口炎病毒為載體的豬傳染性腹瀉病疫苗。

背景技術(shù)：

1、豬流行性腹瀉(ped)是一種尤其針對(duì)仔豬的急性、高傳染性的腸道傳染病，可發(fā)生于任何日齡的豬，年齡越小，癥狀越重，死亡率高。成年豬雖然感染后癥狀較輕，但仍然可以傳播病毒。豬群一旦有豬發(fā)病便會(huì)迅速蔓延，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。

2、引起該病的病原pedv為冠狀病毒科(coronaviridae)α冠狀病毒屬(alphacoronavirus)的正鏈rna病毒，其基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(s)、膜蛋白(m)、包膜蛋白(e)和核衣殼(n)蛋白。其中，s蛋白是pedv宿主保護(hù)性抗原，具有負(fù)責(zé)病毒附著、受體結(jié)合、細(xì)胞膜融合和進(jìn)入的功能，在病毒致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，其外部結(jié)構(gòu)域中存在介導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體的抗原表位及與宿主細(xì)胞結(jié)合的受體結(jié)合位點(diǎn)。

3、目前，對(duì)抗pedv的主要方法是通過生物安全措施和接種疫苗。1994年起，cv777株的滅活和減毒活疫苗的研發(fā)和推廣對(duì)控制pedv感染起到了重要作用。然而，隨著病毒的變異，現(xiàn)有pedv滅活疫苗保護(hù)力有限。

4、水泡性口炎病毒(vesicular?stomatitis?virus,vsv)屬于水泡病毒屬(rhabdoviridae)彈狀病毒科(vesiculovirus)，能感染多種動(dòng)物和昆蟲。家畜中自然感染vsv的有馬、牛(羊)、豬。由于其可以在神經(jīng)節(jié)間順向跨突觸的傳播，因此具有潛在的神經(jīng)毒性。在克服神經(jīng)毒性保證安全性條件下，vsv能夠高效表達(dá)外源蛋白，同時(shí)誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答，是一種具有潛力的疫苗載體，且已經(jīng)得到很好應(yīng)用。

5、鑒于vsv作為疫苗載體所具備的諸多優(yōu)點(diǎn)，以及目前pedv滅活疫苗保護(hù)力不足的問題，本技術(shù)擬利用其研制針對(duì)豬的pedv疫苗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)目前pedv疫苗研制和應(yīng)用存在的諸多問題，提供一種以水泡性口炎病毒為載體的豬傳染性腹瀉病疫苗，該疫苗具有1.安全性高；2.生產(chǎn)便捷等優(yōu)點(diǎn)。

2、為了解決上述問題，本發(fā)明提出以下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種重組病毒載體，所述重組病毒載體的基因組包括將水泡性口炎病毒的基因組中的表面囊膜蛋白編碼基因替換為pedv病毒的刺突蛋白編碼基因；

4、或者，所述重組病毒載體的基因組包括將水泡性口炎病毒的基因組中的表面囊膜蛋白編碼基因替換為pedv病毒的刺突蛋白編碼基因，并在水泡性口炎病毒基因組中插入外源蛋白編碼基因。

5、研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水泡性口炎病毒失去其表面囊膜蛋白g蛋白或g蛋白被其他病毒的囊膜蛋白取代時(shí)，仍可以完成細(xì)胞出芽的過程。而失去g蛋白的水泡性口炎病毒其毒性極大降低，非常適合用作病毒載體。本發(fā)明構(gòu)建的重組病毒載體以vsv為載體，通過將其g蛋白基因替換為豬傳染性腹瀉病毒的s蛋白基因，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，替換了vsv囊膜蛋白的重組vsv能夠有效誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)。

6、進(jìn)一步地，所述pedv病毒來源于g1譜系的病毒或g2譜系的病毒。

7、進(jìn)一步地，所述g1譜系的病毒包括pedv?sd-m株，所述g2譜系的病毒包括nh-ta2020株。

8、所述pedv病毒為pedv?sd-m株，genebankaccessionno.afx98013.1、或者nh-ta2020株，genebankaccession?no.on168803等。

9、進(jìn)一步地，所述pedv病毒的刺突蛋白包括刺突蛋白的截短體，所述截短體選自刺突蛋白c端氨基酸缺失對(duì)應(yīng)的蛋白，所述c端缺失氨基酸個(gè)數(shù)為5個(gè)到19個(gè)。

10、例如，針對(duì)pedv?sd-m株，其刺突蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，對(duì)應(yīng)的截短體的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，或與seq?id?no.3具有至少95％同一性的同功能序列。

11、針對(duì)nh-ta2020株，其刺突蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示，對(duì)應(yīng)的截短體的氨基酸序列如seq?id?no.4所示，或與seq?id?no.4具有至少95％同一性的同功能序列。

12、根據(jù)上述氨基酸序列和密碼子規(guī)則，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲得所述pedv病毒的刺突蛋白(包括截短體)的核苷酸序列，由于密碼子的簡(jiǎn)并性，編碼上述刺突蛋白的核苷酸序列并不唯一，所有能夠編碼上述pedv病毒的刺突蛋白的核苷酸序列均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

13、例如，所述pedv?sd-m株的刺突蛋白的截短體編碼基因的核苷酸序列如seq?idno.5所示，或與seq?id?no.5具有至少95％同源性的同功能序列。

14、所述nh-ta2020株的刺突蛋白的截短體編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.6所示，或與seq?id?no.6具有至少95％同源性的同功能序列。

15、在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明將缺失末尾5-19個(gè)氨基酸的pedv病毒的s蛋白對(duì)應(yīng)編碼基因序列通過同源重組的方式(uniclone?one?step?seamless?cloning?kit)克隆到vsv病毒中的g蛋白基因位置并替換g蛋白基因的orf區(qū)域，構(gòu)建得到的用于預(yù)防pedv的病毒載體。

16、進(jìn)一步地，本發(fā)明的重組病毒載體還包括在水泡性口炎病毒基因組中引入外源蛋白編碼基因，所述外源蛋白為示蹤蛋白或抗原蛋白。引入示蹤蛋白編碼基因以便于通過檢測(cè)熒光等信號(hào)示蹤病毒擴(kuò)增及方便中和抗體的檢測(cè)，引入抗原蛋白有利于多價(jià)多聯(lián)苗的開發(fā)。

17、進(jìn)一步地，所述示蹤蛋白包括綠色熒光蛋白gfp。

18、外源蛋白編碼基因的引入，只會(huì)進(jìn)一步降低重組病毒載體的毒性，增加重組病毒的安全性。所述外源蛋白編碼基因插入在所述水泡性口炎病毒基因組中的核蛋白n編碼基因與磷蛋白p編碼基因之間；或者所述外源蛋白編碼基因插入在所述水泡性口炎病毒基因組中的基質(zhì)蛋白m編碼基因與pedv病毒的刺突蛋白s編碼基因(或刺突蛋白s的截短體編碼基因)之間。

19、第二方面，本發(fā)明提供一種重組病毒，由第一方面所述的重組病毒載體及輔助質(zhì)粒經(jīng)反向遺傳技術(shù)拯救病毒得到；

20、所述重組病毒包含水泡性口炎病毒核蛋白、水泡性口炎病毒磷蛋白、水泡性口炎病毒基質(zhì)蛋白、水泡性口炎病毒rna聚合酶以及pedv病毒的刺突蛋白，且不包含水泡性口炎病毒表面囊膜蛋白；

21、所述重組病毒在細(xì)胞中不添加胰酶情況下具有復(fù)制增殖能力。

22、本發(fā)明提供的重組病毒，經(jīng)病毒拯救后，能夠有效誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，在細(xì)胞中不用添加胰酶具有復(fù)制增殖能力。

23、進(jìn)一步地，所述細(xì)胞包括非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞及其衍生細(xì)胞株，如vero-e6，以及倉鼠腎成纖維細(xì)胞(bhk21)細(xì)胞。

24、需要說明的是，以上所述的替換是指將水泡性口炎病毒基因組中的表面囊膜蛋白編碼基因的orf區(qū)域替換為pedv病毒株的刺突蛋白編碼基因。

25、進(jìn)一步地，所述重組病毒安全性高，對(duì)小鼠不具有神經(jīng)毒性。

26、本發(fā)明還提供所述的重組病毒的制備方法，包括：將所述的重組病毒感染敏感細(xì)胞株，并收獲釋放的病毒。

27、所述敏感細(xì)胞株包括非洲綠猴腎(vero)細(xì)胞及其衍生細(xì)胞株，以及bhk21細(xì)胞。

28、進(jìn)一步地，所述重組病毒的制備方法，在重組病毒感染宿主細(xì)胞過程中不需要添加胰酶。

29、在常規(guī)pedv滅活疫苗的生產(chǎn)過程中，需要胰酶的輔助pedv才能夠正常在細(xì)胞中感染和擴(kuò)增，而胰酶的添加會(huì)使得后續(xù)純化時(shí)間和經(jīng)濟(jì)成本增加，本發(fā)明提供的重組病毒的制備方法中，不需要添加胰酶即可收獲高滴度的病毒，大大節(jié)省了病毒的生產(chǎn)純化成本。

30、本發(fā)明還提供一種利用所述重組病毒載體制備得到的疫苗株。

31、第三方面，本發(fā)明還提供一種水泡性口炎病毒為載體的豬傳染性腹瀉病疫苗，所述疫苗包括第二方面所述的重組病毒；上述的疫苗株；

32、或者，所述疫苗包括第二方面所述的重組病毒的滅活病毒。

33、本發(fā)明還提供所述的重組病毒載體、所述的重組病毒或所述的疫苗株或所述的疫苗的以下任一種應(yīng)用：

34、(1)在制備表達(dá)pedv病毒刺突蛋白的重組水泡性口炎病毒中的應(yīng)用；

35、(2)在制備用于預(yù)防和/或治療pedv感染或由pedv感染引起疾病的藥物中的應(yīng)用；

36、(3)在制備預(yù)防豬傳染性腹瀉病毒傳播和感染疫苗中的應(yīng)用。。

37、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所能達(dá)到的技術(shù)效果包括：

38、本發(fā)明提供的重組病毒載體通過分子生物學(xué)技術(shù)，將水泡性口炎病毒的基因組中的表面囊膜蛋白編碼基因替換為pedv病毒的刺突蛋白基因，失去表面囊膜蛋白的水泡性口炎病毒其毒性極大降低，非常適合用作病毒載體。

39、本發(fā)明提供的重組病毒的制備方法，將重組病毒感染宿主細(xì)胞，不需要添加外源胰酶重組病毒即可完成復(fù)制增殖，收獲高滴度的病毒，在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中將有效縮減生產(chǎn)純化病毒的成本。

40、本發(fā)明提供的水泡性口炎病毒為載體的豬傳染性腹瀉病疫苗，以vsv為載體，將其g蛋白基因替換為豬傳染性腹瀉病毒的s蛋白基因，利用反式遺傳技術(shù)構(gòu)建得到的用于預(yù)防pedv的重組疫苗，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的重組疫苗具有良好的安全性和有效性。

41、本發(fā)明提供的水泡性口炎病毒為載體的豬傳染性腹瀉病疫苗以vsv為載體，將其g蛋白基因替換為豬傳染性腹瀉病毒的s蛋白基因，或?qū)⑵鋑蛋白基因替換為豬傳染性腹瀉病毒的s蛋白基因并插入外源蛋白編碼基因gfp，利用反式遺傳技術(shù)構(gòu)建得到，重組病毒在細(xì)胞水平具有良好的生長(zhǎng)特性，連續(xù)傳代后表現(xiàn)良好的遺傳穩(wěn)定性和生長(zhǎng)特性。在安全性評(píng)價(jià)方面，通過采用balb/c小鼠作為動(dòng)物模型進(jìn)行研究。結(jié)果表明該疫苗通過肌肉及顱內(nèi)途徑給藥后，小鼠未表現(xiàn)出不良反應(yīng)及臨床癥狀，體重變化平穩(wěn)，顯示出該疫苗的良好安全性。在有效性方面，實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供的豬傳染性腹瀉病疫苗的初步研究結(jié)果表現(xiàn)優(yōu)良，血清中和抗體效價(jià)均顯著高于對(duì)照組小鼠血清中和抗體水平：在仔豬上進(jìn)行免疫后，本發(fā)明提供的豬傳染性腹瀉病疫苗能夠誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生較高抗體水平。首免后33d，仔豬血清中和抗體水平顯著高于從臨床陽性血清中測(cè)得的抗體水平。這一結(jié)果不僅證明了本發(fā)明提供的豬傳染性腹瀉病疫苗的潛在有效性，也為進(jìn)一步針對(duì)pedv疫苗的研究和開發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。我們期待該疫苗能在未來為養(yǎng)豬業(yè)提供一種安全、有效的防控pedv的新策略。