本發(fā)明屬于分子檢測(cè)，具體涉及一種用于檢測(cè)猴痘病毒的引物探針組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、猴痘是由猴痘病毒感染所導(dǎo)致的人畜共患傳染病。猴痘潛伏期5-21天，多為6-13天。臨床表現(xiàn)主要為多形性皮膚病變(包括丘疹、水泡、膿皰、潰瘍病變和痂)、發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大。

2、猴痘病毒屬于痘病毒科正痘病毒屬猴痘病毒種，病毒基因組為大小約197kb的線性雙鏈dna。猴痘分型的重要性在于它能夠影響疾病的嚴(yán)重程度和病死率。根據(jù)搜索結(jié)果，猴痘病毒(mpxv)分為兩個(gè)不同的分支：西非分支和中非分支(曾命名為剛果盆地分支)。這兩個(gè)分支在病毒的致病性和病死率上有顯著差異。西非分支的病死率大約是3％，而中非分支的病死率則高達(dá)10％左右。這種差異意味著不同分支的病毒可能需要不同的公共衛(wèi)生應(yīng)對(duì)策略和治療方法。

3、猴痘病毒變異株是猴痘病毒(mpxv)的一個(gè)進(jìn)化枝，屬于中非分支的子進(jìn)化枝。猴痘病毒變異株的危害在于它能夠引起人類感染，并且與西非分支相比，中非分支通常與更嚴(yán)重的疾病和更高的病死率相關(guān)聯(lián)。

4、猴痘變異株的危害主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

5、1.傳染性：猴痘病毒可以通過(guò)密切接觸傳播，包括皮膚對(duì)皮膚的接觸、口對(duì)口或口對(duì)皮膚的接觸，以及通過(guò)受污染的物品。此外，病毒也可通過(guò)接觸被病毒污染的物品、長(zhǎng)時(shí)間近距離吸入病例呼吸道飛沫的方式傳播。

6、2.臨床癥狀：感染猴痘1b型后，患者可能會(huì)出現(xiàn)皮疹、發(fā)熱、頭痛、肌痛、背痛、乏力和淋巴結(jié)腫大等癥狀。皮疹會(huì)經(jīng)歷從斑疹、丘疹、皰疹、膿皰疹到結(jié)痂的變化，可能會(huì)在身體的任何部位出現(xiàn)，包括手掌和腳底、面部、口腔和喉嚨、腹股溝和生殖器部位等。

7、3.并發(fā)癥：猴痘可能導(dǎo)致一些并發(fā)癥，包括皮損部位繼發(fā)細(xì)菌感染、支氣管肺炎、腦炎、角膜感染、膿毒癥等。嚴(yán)重病例常見(jiàn)于年幼兒童、免疫功能低下人群，預(yù)后與感染的病毒分支、病毒暴露程度、既往健康狀況和并發(fā)癥嚴(yán)重程度等有關(guān)。

8、4.病死率：猴痘病毒變異株所屬的中非分支的病死率通常高于西非分支，據(jù)報(bào)告，西非分支的病死率約為3％，而中非分支的病死率約為10％。

9、5.全球影響：2022年全球多地報(bào)告了猴痘病例，包括一些非流行國(guó)家，這表明猴痘病毒的傳播可能已經(jīng)超出了其傳統(tǒng)流行區(qū)域，對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了新的挑戰(zhàn)。

10、綜上所述，猴痘病毒變異株的危害在于其傳染性、臨床癥狀、可能導(dǎo)致的并發(fā)癥以及較高的病死率，這些都對(duì)公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了威脅。因此，對(duì)于猴痘病毒變異株的預(yù)防和控制至關(guān)重要。

11、此外，了解病毒的分支還有助于流行病學(xué)調(diào)查，可以幫助公共衛(wèi)生專家追蹤病毒的傳播路徑，識(shí)別可能的感染源，以及評(píng)估疫情的嚴(yán)重性和潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。這對(duì)于制定有效的預(yù)防和控制措施至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明第一方面的目的，在于提供一種引物探針組合。

2、本發(fā)明第二方面的目的，在于提供一種試劑盒。

3、本發(fā)明第三方面的目的，在于提供上述試劑盒的制備方法。

4、本發(fā)明第四方面的目的，在于上述引物探針組或試劑盒的應(yīng)用。

5、本發(fā)明第五方面的目的，在于提供一種檢測(cè)和/或分型猴痘病毒的方法。

6、本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

7、本發(fā)明的第一方面，提供一種引物探針組合，包括用于檢測(cè)猴痘病毒變異株、猴痘病毒西非株、猴痘病毒中非株中至少一種的引物探針組；所述引物探針組包括引物對(duì)和探針；

8、所述用于檢測(cè)猴痘病毒變異株的引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?idno.2所示；

9、所述用于檢測(cè)猴痘病毒變異株的探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

10、所述用于檢測(cè)猴痘病毒西非株的引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no.4和seq?idno.5所示；

11、所述用于檢測(cè)猴痘病毒西非株的探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；

12、所述用于檢測(cè)猴痘病毒中非株的引物對(duì)的核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?idno.8所示；

13、所述用于檢測(cè)猴痘病毒中非株的探針的核苷酸序列如seq?id?no.9所示。

14、優(yōu)選地，所述探針的兩端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基因和熒光淬滅基因。

15、優(yōu)選地，所述探針5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基因，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基因。

16、優(yōu)選地，所述熒光報(bào)告基因選自fam、vic、rox、cy5、hrf705和cy3中的至少一種；所述熒光淬滅基因選自ddq、bhq1、bhq2、bhq3、tamra和nfq中的至少一種。

17、當(dāng)檢測(cè)猴痘病毒變異株、猴痘病毒西非株、猴痘病毒中非株中的至少兩種時(shí)，各探針序列之間標(biāo)記的熒光基團(tuán)不同。

18、本發(fā)明的第二方面，提供一種試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明第一方面所述的引物探針組。

19、優(yōu)選地，所述引物對(duì)中上游引物、下游引物和探針的摩爾比為(1～3):(1～3):1。

20、優(yōu)選地，所述試劑盒還包括pcr緩沖液、dntp、taq?dna聚合酶中的一種或多種。

21、本發(fā)明的第三方面，提供上述試劑盒的制備方法，包括以下步驟：將引物探針組、pcr緩沖液、dntp、taq?dna聚合酶混合、即得。

22、本發(fā)明的第四方面，提供上述引物探針組合、試劑盒在檢測(cè)和/或分型猴痘病毒中的應(yīng)用，所述猴痘病毒包括：猴痘病毒變異株、猴痘病毒西非株和猴痘病毒中非株中的一種或多種。

23、本發(fā)明的第五方面，提供一種檢測(cè)和/或分型猴痘病毒的方法，包含以下步驟：

24、(1)提取樣品的dna；

25、(2)采用本發(fā)明第一方面所述的引物探針組或本發(fā)明第二方面所述的試劑盒對(duì)樣品的rna進(jìn)行pcr檢測(cè)，分析檢測(cè)結(jié)果；

26、該方法非診斷目的；

27、所述猴痘病毒包括：猴痘病毒變異株、猴痘病毒西非株和猴痘病毒中非株中的一種或多種。

28、優(yōu)選地，步驟(2)中所述pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2min；95℃5s，60℃15s，45個(gè)循環(huán)。

29、本發(fā)明的有益效果是：

30、本發(fā)明通過(guò)針對(duì)猴痘病毒中非株(clade?i)g2r基因、西非株(clade?ii)g2r基因和變異毒株(clade?ib)g2r基因設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的引物探針組合；從而能夠特異性的擴(kuò)增目標(biāo)序列，檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的病原；基于引物探針可以使用多重?zé)晒鈖cr技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)管中檢測(cè)并分型3種病原，從而提高檢測(cè)效率。各種病原檢測(cè)引物和探針之間不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，且引物和引物之間、引物和探針之間、以及探針和探針之間不會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，保證了檢測(cè)效率和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；檢測(cè)靈敏度高可以達(dá)到250copy/ml、特異性高，與牛痘，水痘，皰疹病毒等病原無(wú)交叉反應(yīng)。

技術(shù)特征：

1.一種引物探針組合，包括用于檢測(cè)猴痘病毒變異株、猴痘病毒西非株、猴痘病毒中非株中至少一種的引物探針組；所述引物探針組包括引物對(duì)和探針；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述用于檢測(cè)猴痘病毒變異株的探針的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述用于檢測(cè)猴痘病毒西非株的探針的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；所述用于檢測(cè)猴痘病毒中非株的探針的核苷酸序列如seq?id?no.9所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的引物探針組合，其特征在于，所述探針的兩端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基因和熒光淬滅基因；優(yōu)選地，所述探針5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基因，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基因。

4.一種試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的引物探針組。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述引物對(duì)中上游引物、下游引物和探針的摩爾比為(1～3):(1～3):1。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括pcr緩沖液、dntp、taqdna聚合酶中的一種或多種。

7.權(quán)利要求6所述試劑盒的制備方法，包括以下步驟：將引物探針組、pcr緩沖液、dntp、taq?dna聚合酶混合，即得。

8.權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的引物探針合或權(quán)利要求4～6任一項(xiàng)試劑盒在檢測(cè)和/或分型猴痘病毒中的應(yīng)用；優(yōu)選地，所述猴痘病毒包括：猴痘病毒變異株、猴痘病毒西非株和猴痘病毒中非株中的一種或多種。

9.一種檢測(cè)和/或分型猴痘病毒的方法，包含以下步驟：

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述pcr的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃2min；95℃5s，60℃15s，45個(gè)循環(huán)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)猴痘病毒的引物探針組合及其應(yīng)用；所述引物探針的序列如SEQ?ID?NO.1～SEQ?ID?NO.9所示；本發(fā)明的引物探針能夠特異性的擴(kuò)增中非分支CladeⅠ、西非分支CladeⅡ、中非分支變異株Clade?Ib中的目標(biāo)序列，檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的病原；基于引物探針可以使用多重?zé)晒釶CR技術(shù)，在一個(gè)反應(yīng)管中檢測(cè)并分型3種病原，從而提高檢測(cè)效率。各種病原檢測(cè)引物和探針之間不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)，且引物、探針之間不會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，保證了檢測(cè)效率和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；檢測(cè)靈敏度高可以達(dá)到250copy/ml、特異性高，與牛痘，水痘，皰疹病毒等病原無(wú)交叉反應(yīng)。

技術(shù)研發(fā)人員：黃利群,黃輝濤,林毅雄,李輝,門光琦
受保護(hù)的技術(shù)使用者：珠海市疾病預(yù)防控制中心
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6