本發(fā)明屬于菌種檢測，尤其涉及一種巨大側(cè)耳pg7031菌種的ssr標記指紋圖譜及其構(gòu)建方法與應用。

背景技術：

1、巨大側(cè)耳(pleurotus?giganteus(berk.)karun.&k.d.hyde)，是國內(nèi)開發(fā)的一種珍稀食用菌，其口感和風味獨特，有豬肚般的滑膩，因而其商品名為“豬肚菇”；巨大側(cè)耳營養(yǎng)豐富，富含多糖、蛋白質(zhì)、粗纖維等營養(yǎng)物質(zhì)，并且具有抗炎、抗腫瘤、抗真菌、保護肝臟等多種藥用功效，深受消費者喜愛，具有較高的潛在市場價值。

2、然而，隨著巨大側(cè)耳產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，巨大側(cè)耳生產(chǎn)用種“同物異名，同名異物”的問題日益突出；本團隊前期在國內(nèi)收集了20株巨大側(cè)耳菌株，研究發(fā)現(xiàn)僅有7株具有不同的遺傳背景，其他菌株均為同物異名；這一問題不僅損害了巨大側(cè)耳育種者的知識產(chǎn)權，更為生產(chǎn)者造成了極大地風險，為巨大側(cè)耳產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展造成了隱患；為保障育種者的權益和降低生產(chǎn)者的風險，促進我國巨大側(cè)耳產(chǎn)業(yè)健康、穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展，建立一種簡便、快速、可靠的巨大側(cè)耳菌種特異性鑒定技術迫在眉睫。

3、隨著分子生物學的快速發(fā)展，dna測序技術的不斷成熟，高通量測序的成本也在降低；dna分子標記技術能夠從基因水平上檢測巨大側(cè)耳菌種的遺傳特異性，巨大側(cè)耳全基因組測序的完成為ssr標記的開發(fā)提供了便利；ssr分子標記是一種基于高通量測序技術的應用，降低了ssr標記開發(fā)的成本，適用于巨大側(cè)耳全基因組測序分子標記的開發(fā)；ssr標記具有數(shù)量豐富、準確性高、穩(wěn)定性好、快捷簡便等優(yōu)點，不僅用于分子標記輔助育種，而且也可用于巨大側(cè)耳菌株鑒定。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供一種具有檢測時間短、準確性高和重復性好的pg7031菌種。

2、本發(fā)明采用的技術方案如下：一種巨大側(cè)耳pg7031菌種的ssr標記指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

3、s1、菌絲培養(yǎng)：將巨大側(cè)耳菌種轉(zhuǎn)接到pda培養(yǎng)基的平板上，恒溫暗培養(yǎng)，7天后收集菌絲；

4、s2、基因組dna的提?。豪弥参锘蚪Mdna提取試劑盒，按照試劑盒中的操作步驟提取上述菌絲的基因組dna；通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計法檢測基因組dna的濃度和純度，并調(diào)整樣品dna的濃度；

5、s3、ssr分子標記的檢測：對提取的基因組dna進行ssr分子標記的pcr擴增；

6、s4、電泳檢測：將擴增得到的pcr產(chǎn)物與上樣緩沖液混勻后，電泳，銀染，顯色，拍照。

7、進一步地，所述s2基因組dna的提取，其具體工藝包括：

8、s201、取定量菌絲體放入的離心管中，加入液氮充分研磨；

9、s202、向研磨的粉末中快速加入buffer?lp1和rnase?a，渦旋振蕩，室溫放置，使其充分裂解；

10、s203、向裂解液中加入buffer?lp2，上下顛倒混勻后，渦旋振蕩預定時間；

11、s204、特定轉(zhuǎn)速下離心預定時間，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中；

12、s205、加入buffer?lp3，上下顛倒混勻；

13、s206、將上步所得溶液和沉淀全部轉(zhuǎn)移到已裝入收集管的吸附柱中，特定轉(zhuǎn)速下離心預定時間，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

14、s207、向吸附柱中加入buffer?gw2，特定轉(zhuǎn)速下離心預定時間，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；

15、s208、重復步驟s207；

16、s209、特定轉(zhuǎn)速下離心預定時間，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入新的離心管中，室溫放置，直至徹底晾干；

17、s210、向吸附柱的膜中間懸空滴加buffer?ge，室溫放置預定時間，特定轉(zhuǎn)速下離心預定時間，收集dna溶液；

18、s211、取dna溶液，分別在瓊脂糖凝膠和分光光度計上檢測dna濃度和純度。

19、進一步地，所述s3中ssr分子標記的檢測中的pcr反應條件為：94℃5min，94℃40s，60℃40s，72℃1min，72℃10min，進行30個循環(huán)。

20、進一步地，所述指紋圖譜由10對ssr標記組成，其對應的10對ssr標記引物序列如下：

21、pgssr23的正/反向引物分別為：

22、gtatttttgttctttgccatcca/tcccaaaggtaaaatgtgtcaac；

23、pgssr24的正/反向引物分別為：

24、tggattatacgtttacgagaccg/agcacaccgtttagaagaaatca；

25、pgssr31的正/反向引物分別為：

26、gacgtagaataacatttcggctg/aaggtgaactaaaacgcactctg；

27、pgssr32的正/反向引物分別為：

28、gtaatggtcccaatggtcctc/cctacattgtcatcaccatttgt；

29、pgssr34的正/反向引物分別為：

30、tacataccaaaccccatacaacc/ggatagttctcgatacgaaggct；

31、pgssr35的正/反向引物分別為：

32、gcagtagattctgtggcttgaac/actgattgggagtgacaaaagaa；

33、pgssr46的正/反向引物分別為：

34、cgagaaaacaagctatcgtgagt/cgatcgtctgttgtacctttcat；

35、pgssr68的正/反向引物分別為：

36、gtaggttgtgcagaagagatgct/gcacctcgatttgttgttatctc；

37、pgssr86的正/反向引物分別為：

38、atacatatgctcgttggtcgtct/ggagagagagagagaagccagtc；

39、pgssr91的正/反向引物分別為：

40、ctgatcggcttcctcatctagt/cagagtagtgccatctccaagtt。

41、進一步地，所述s4中電泳檢測的方法為：

42、取擴增得到的pcr產(chǎn)物與變性凝膠緩沖液依次混勻后，在聚丙烯酰胺凝膠的點樣孔中點樣；

43、銀染和顯色的具體工藝為：電泳結(jié)束后將玻璃板拆開，取膠板用去離子水水洗預定時間，然后放入銀染液中避光銀染預定時間，銀染后再用去離子水水洗預定時間，放入顯影液中至顯現(xiàn)出清晰條帶后，用去離子水水洗預定時間，在生物大分子分析儀中拍照并記錄條帶特征。

44、本發(fā)明還提供了另外一種技術方案：

45、利用巨大側(cè)耳全基因組開發(fā)的10對ssr標記引物，對巨大側(cè)耳菌種進行ssr標記擴增，將得到的帶型與巨大側(cè)耳pg7031菌種的帶型對照，與該帶型一致即為巨大側(cè)耳pg7031菌種。

46、采用上述結(jié)構(gòu)后，本發(fā)明有益效果如下：本發(fā)明的巨大側(cè)耳pg7031菌種的ssr標記指紋圖譜可用于pg7031菌種的鑒別，本發(fā)明與常規(guī)的形態(tài)學鑒定、拮抗試驗和出菇實驗相比，具有檢測時間短、準確性高、可重復性好的優(yōu)點；檢測所需時間只需要3-4天，而常規(guī)的拮抗試驗所需時間至少需要1周時間，出菇試驗則需要至少2個月的時間；該方法在所收集的7個遺傳背景不同的巨大側(cè)耳菌種中具有pg7031菌種的專一性，具有良好的應用前景。