本發(fā)明屬于分子生物學及細胞免疫學的醫(yī)藥，具體涉及針對乙型肝炎病毒核心蛋白的單克隆抗體及其制備與應用。

背景技術：

1、乙型肝炎病毒(hepatitisb?virus，hbv)感染仍然是全球重大的公共衛(wèi)生問題。目前，針對慢性乙肝的抗病毒藥物核苷(酸)類似物(nas)和干擾素-α(ifn-α)雖可有效抑制hbvdna的復制和疾病進展，但是功能性治愈率很低。因此，仍然迫切需要開發(fā)更有效的策略用于hbv感染的檢測和治療。

2、hbv是一種嗜肝dna病毒，直徑約42nm，其內部衣殼由核心蛋白(hepatitisbcoreprotein，hbc)組裝而成。在大多數(shù)hbv基因型中，核心蛋白由183個氨基酸(a.a.)組成，包含一個用于形成衣殼的n端組裝結構域(1-149a.a.)和一個用于與核酸結合和核定位的富含精氨酸的c端結構域(150-183a.a.)。hbc首先形成二聚體，通常情況下再由120個二聚體自組裝成具有t＝4二十面體對稱性的衣殼，衣殼包裹著病毒的rna和聚合酶，不僅為病毒rna的逆轉錄過程提供了一個密閉的環(huán)境，而且還可促進核衣殼包裝和病毒粒子的形成。另外，hbc可調節(jié)衣殼轉運入細胞核，并與感染期間cccdna的形成相關。hbc除了作為結構蛋白以及在病毒生命周期的多個階段發(fā)揮調節(jié)功能外，還可通過抑制宿主免疫反應或激活mapk通路和wnt/β-catenin通路等多條信號通路在hbv相關疾病的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。hbc這些方面的功能提示其可成為hbv檢測和干預的重要靶點。

3、hbv相關的研究主要通過對細胞上清中表面抗原、e抗原和hbvdna的檢測，間接評估hbv感染滴度。而目前可用于hbv多種基因型檢測和多種生化實驗如酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)、免疫印跡法(westernblot)、免疫熒光法(ifa)、流式細胞術、免疫斑點法、免疫組織化學(ihc)等的抗hbc單克隆抗體甚少，這對直接檢測hbv感染的細胞造成困難。因此，開發(fā)靈敏度更高、廣譜性更強的抗hbc單克隆抗體，對于hbv相關研究的發(fā)展非常重要。

技術實現(xiàn)思路

1、為了能夠適用于多種hbv基因型檢測和多種生化實驗方法的檢測，本發(fā)明篩選獲得了8株針對hbv核心蛋白的單克隆抗體，其具有高效、廣譜性、多用途的特點。本發(fā)明進一步提供了使用針對hbc的單克隆抗體用于多種方法檢測hbv病毒感染，上述單克隆抗體對hbv核心蛋白具有很強的特異性結合能力，并可通過多種生化實驗檢測hbv的核心蛋白，上述單克隆抗體有望成為hbv活病毒感染的檢測抗體，為多種hbv基因型的抗原檢測提供了強有力的工具。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

3、本發(fā)明的第一個方面是提供針對乙型肝炎病毒核心蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體識別乙型肝炎病毒hbv的核心蛋白hbc。

4、進一步地，所述單克隆抗體為廣譜性人源單克隆抗體，可識別hbv所有基因型的hbc，hbv基因型包括a、b、c、d、e、f、g、h、i、j。

5、進一步地，所述單克隆抗體為cabb8、cabd8、cabe2、cabe5、cabe11、cabf5、cabf12、cabh8中之一或其任意組合；其中，所述cabb8的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seq?id?no.1、seq?id?no.2和seq?id?no.3，所述cabb8的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.4、“wss”和seq?id?no.5；

6、所述cabd8的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seqid?no.15、seq?id?no.16和seq?id?no.17，所述cabd8的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.18、“dat”和seq?id?no.19；

7、所述cabe2的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seqid?no.29、seq?id?no.30和seq?id?no.31，所述cabe2的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.32、“gat”和seq?id?no.33；

8、所述cabe5的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seqid?no.43、seq?id?no.44和seq?id?no.45，所述cabe5的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.46、“gkn”和seq?id?no.47；

9、所述cabe11的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seqid?no.57、seq?id?no.58和seq?id?no.59，所述cabe11的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.60、“dvs”和seq?id?no.61；

10、所述cabf5的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seqid?no.71、seq?id?no.72和seq?id?no.73，所述cabf5的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.74、“kas”和seq?id?no.75；

11、所述cabf12的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seqid?no.85、seq?id?no.86和seq?id?no.87，所述cabf12的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.88、“aas”和seq?id?no.89；

12、所述cabh8的重鏈可變區(qū)vh的cdr1-h、cdr2-h和cdr3-h的氨基酸序列分別為seqid?no.99、seq?id?no.100和seq?id?no.101，所述cabh8的輕鏈可變區(qū)vl的cdr1-l、cdr2-l和cdr3-l的氨基酸序列分別為seq?id?no.102、“gas”和seq?id?no.103。

13、進一步地，所述cabb8的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.11所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述cabb8的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?idno.12所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列；

14、所述cabd8的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.25所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述cabd8的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?id?no.26所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列；

15、所述cabe2的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.39所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述cabe2的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?id?no.40所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列；

16、所述cabe5的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.53所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述cabe5的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?id?no.54所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列；

17、所述cabe11的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.67所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述cabe11的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?id?no.68所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列；

18、所述cabf5的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.81所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述cabf5的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?id?no.82所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列；

19、所述cabf12的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.95所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述cabf12的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?id?no.96所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列；

20、所述cabh8的重鏈可變區(qū)vh的氨基酸序列如seq?id?no.109所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列，所述cabh8的輕鏈可變區(qū)vl的氨基酸序列如seq?id?no.110所示或與其具有至少80％一致性的氨基酸序列。

21、可理解的是，重鏈序列和配對的輕鏈序列構成了上述單克隆抗體，并且它們的可變區(qū)決定了抗體對抗原的結合識別及特異性，抗體特異性取決于抗體結合位點和抗原決定區(qū)間的相互作用。重鏈和輕鏈的結合位點都主要由3個互補決定區(qū)(cdr)的殘基組成，cdr間通過框架區(qū)(fr)進行銜接。由此，本領域的技術人員在獲知cdr的氨基酸序列后，可輕易確定框架區(qū)。即，在重鏈和輕鏈的cdr序列不變情況下，能夠基本實現(xiàn)本發(fā)明單克隆抗體的功能和應用。因此，本發(fā)明的單克隆抗體，其具體序列不僅限于以上具體的重鏈序列可變區(qū)和輕鏈序列可變區(qū)，以上具體序列的可變區(qū)只是本發(fā)明的一種實現(xiàn)方式中具體采用的單克隆抗體序列。

22、由與參照序列“至少80％一致性”的氨基酸序列組成的蛋白，與參照序列相比可包含突變如缺失、插入和/或取代。在取代的情況中，與參照序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列組成的蛋白，可對應源自不同于參照序列的物種的同源序列?！鞍被崛〈笨梢允潜Ｊ鼗蚍潜Ｊ氐摹?yōu)選地，取代為保守取代，其中一個氨基酸由具有相似結構和/或化學性質的另一氨基酸取代。具體地，重鏈或輕鏈可變區(qū)的序列與參照序列區(qū)別僅在于保守氨基酸取代。

23、本發(fā)明的第二個方面是提供與本發(fā)明第一個方面所述的單克隆抗體相關的生物材料，所述生物材料選自下述(a)～(b)中的一種：

24、(a)編碼本發(fā)明第一個方面所述單克隆抗體的核酸分子；

25、(b)含有(a)中所述核酸分子的表達盒、重組載體、重組細胞系。

26、進一步地，所述表達盒、重組載體、重組細胞系可用于表達上述重鏈序列、輕鏈序列或單克隆抗體。

27、進一步地，編碼seq?id?no.1所示cabb8的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.6所示；

28、編碼seq?id?no.2所示cabb8的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.7所示；

29、編碼seq?id?no.3所示cabb8的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.8所示；

30、編碼seq?id?no.4所示cabb8的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.9所示；

31、編碼cabb8的cdr2-l的核酸序列為“tggtcatct”；

32、編碼seq?id?no.5所示cabb8的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.10所示；

33、編碼seq?id?no.15所示cabd8的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.20所示；

34、編碼seq?id?no.16所示cabd8的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.21所示；

35、編碼seq?id?no.17所示cabd8的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.22所示；

36、編碼seq?id?no.18所示cabd8的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.23所示；

37、編碼cabd8的cdr2-l的核酸序列為“gatgcaacc”；

38、編碼seq?id?no.19所示cabd8的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.24所示；

39、編碼seq?id?no.29所示cabe2的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.34所示；

40、編碼seq?id?no.30所示cabe2的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.35所示；

41、編碼seq?id?no.31所示cabe2的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.36所示；

42、編碼seq?id?no.32所示cabe2的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.37所示；

43、編碼cabe2的cdr2-l的核酸序列為“ggtgcaacc”；

44、編碼seq?id?no.33所示cabe2的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.38所示；

45、編碼seq?id?no.43所示cabe5的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.48所示；

46、編碼seq?id?no.44所示cabe5的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.49所示；

47、編碼seq?id?no.45所示cabe5的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.50所示；

48、編碼seq?id?no.46所示cabe5的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.51所示；

49、編碼cabe5的cdr2-l的核酸序列為“ggtaaaaac”；

50、編碼seq?id?no.47所示cabe5的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.52所示；

51、編碼seq?id?no.57所示cabe11的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.62所示；

52、編碼seq?id?no.58所示cabe11的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.63所示；

53、編碼seq?id?no.59所示cabe11的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.64所示；

54、編碼seq?id?no.60所示cabe11的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.65所示；

55、編碼cabe11的cdr2-l的核酸序列為“gatgtcagt”；

56、編碼seq?id?no.61所示cabe11的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.66所示；

57、編碼seq?id?no.71所示cabf5的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.76所示；

58、編碼seq?id?no.72所示cabf5的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.77所示；

59、編碼seq?id?no.73所示cabf5的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.78所示；

60、編碼seq?id?no.74所示cabf5的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.79所示；

61、編碼cabf5的cdr2-l的核酸序列為“aaggcgtcg”；

62、編碼seq?id?no.75所示cabf5的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.80所示；

63、編碼seq?id?no.85所示cabf12的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.90所示；

64、編碼seq?id?no.86所示cabf12的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.91所示；

65、編碼seq?id?no.87所示cabf12的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.92所示；

66、編碼seq?id?no.88所示cabf12的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.93所示；

67、編碼cabf12的cdr2-l的核酸序列為“gctgcgtcc”；

68、編碼seq?id?no.89所示cabf12的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.94所示；

69、編碼seq?id?no.99所示cabh8的cdr1-h的核酸序列如seq?id?no.104所示；

70、編碼seq?id?no.100所示cabh8的cdr2-h的核酸序列如seq?id?no.105所示；

71、編碼seq?id?no.101所示cabh8的cdr3-h的核酸序列如seq?id?no.106所示；

72、編碼seq?id?no.102所示cabh8的cdr1-l的核酸序列如seq?id?no.107所示；

73、編碼cabh8的cdr2-l的核酸序列為“ggtgcgtcc”；

74、編碼seq?id?no.103所示cabh8的cdr3-l的核酸序列如seq?id?no.108所示。

75、5.根據(jù)權利要求3所述的生物材料，其特征在于，

76、編碼seq?id?no.11所示cabb8的vh的核酸序列如seq?id?no.13所示；

77、編碼seq?id?no.12所示cabb8的vl的核酸序列如seq?id?no.14所示；

78、編碼seq?id?no.25所示cabd8的vh的核酸序列如seq?id?no.27所示；

79、編碼seq?id?no.26所示cabd8的vl的核酸序列如seq?id?no.28所示；

80、編碼seq?id?no.39所示cabe2的vh的核酸序列如seq?id?no.41所示；

81、編碼seq?id?no.40所示cabe2的vl的核酸序列如seq?id?no.42所示；

82、編碼seq?id?no.53所示cabe5的vh的核酸序列如seq?id?no.55所示；

83、編碼seq?id?no.54所示cabe5的vl的核酸序列如seq?id?no.56所示；

84、編碼seq?id?no.67所示cabe11的vh的核酸序列如seq?id?no.69所示；

85、編碼seq?id?no.68所示cabe11的vl的核酸序列如seq?id?no.70所示；

86、編碼seq?id?no.81所示cabf5的vh的核酸序列如seq?id?no.83所示；

87、編碼seq?id?no.82所示cabf5的vl的核酸序列如seq?id?no.84所示；

88、編碼seq?id?no.95所示cabf12的vh的核酸序列如seq?id?no.97所示；

89、編碼seq?id?no96所示cabf12的vl的核酸序列如seq?id?no.98所示；

90、編碼seq?id?no.109所示cabh8的vh的核酸序列如seq?id?no.111所示；

91、編碼seq?id?no.110所示cabh8的vl的核酸序列如seq?id?no.112所示。

92、可理解的是，以上具體的核酸序列只是本發(fā)明的一種實現(xiàn)方式中具體采用的核酸序列，根據(jù)密碼子的簡并性，在保障編碼氨基酸序列不變的情況下，除了以上限定的核酸序列以外，可以編碼出相同重鏈序列或輕鏈序列的若干種核酸序列(例如保守核苷酸序列變體源于遺傳密碼簡并和沉默的變體，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在內)，都在本發(fā)明的保護范圍內。

93、上述生物材料中，含有編碼抗體的核酸分子的表達盒，是指能夠在宿主細胞中表達所述抗體的dna，該dna不但可包括啟動所述抗體基因轉錄的啟動子，還可包括終止所述抗體基因轉錄的終止子。

94、上述生物材料中，載體是可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可通過轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內得以表達，載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。

95、上述生物材料中，宿主細胞指的是導入載體的細胞，包括原核細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、動物細胞等，例如大腸桿菌、酵母細胞、s2果蠅細胞、bhk細胞、cho細胞、hek293細胞。上述表達盒、重組載體、重組細胞系均可采用本領域常規(guī)方法制備。

96、本發(fā)明的第三個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的單克隆抗體的制備方法，所述方法包括：將含有編碼所述單克隆抗體的核酸分子的重組載體轉染宿主細胞；培養(yǎng)轉染后的宿主細胞并收集上清液，純化獲得所述單克隆抗體。

97、進一步地，所述重組載體為pcdna3.4質粒，所述宿主細胞為293f細胞。

98、本發(fā)明的第四個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二個方面所述的生物材料或采用本發(fā)明第三個方面所述的制備方法制得的單克隆抗體在制備檢測或診斷hbv的產品中的應用。

99、本發(fā)明的第五個方面是提供一種用于檢測或診斷hbv的產品，所述產品包含本發(fā)明第一個方面所述的單克隆抗體、本發(fā)明第二個方面所述的生物材料或采用本發(fā)明第三個方面所述的制備方法制得的單克隆抗體。

100、進一步地，上述產品可為診斷試劑(診斷試劑盒)、檢測試劑(檢測試劑盒)等，其還可包括其他反應試劑。上述產品可應用于elisa、流式細胞術、免疫熒光方法來檢測hbv的核心蛋白hbc。

101、本發(fā)明的第六個方面是提供一種非診斷目的的檢測hbv或其hbc的方法，所述方法包括：采用本發(fā)明第五個方面所述的產品與待檢樣品混合以檢測hbv的核心蛋白hbc。

102、上述待檢樣品涵蓋從受試者獲得的多種樣品類型且可在診斷或檢測中使用，包括但不限于血液和其他生物來源的液體樣品、固體組織樣品，涵蓋臨床樣品、培養(yǎng)基中的細胞、細胞上清、細胞裂解物、血清、血漿、生物液體和組織樣品等。

103、進一步地，檢測的方法包括：elisa、流式細胞術和免疫熒光方法。

104、可理解的是，在實際應用中，可分別單獨使用cabb8、cabd8、cabe2、cabe5、cabe11、cabf5、cabf12、cabh8，也可以聯(lián)合使用多種抗體制成的組合物，以檢測hbv的核心蛋白hbc。

105、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明采用上述技術方案具有以下有益效果：

106、本發(fā)明篩選獲得的針對乙型肝炎病毒核心蛋白的單克隆抗體與hbc結合能力強。本發(fā)明通過實施例驗證了單克隆抗體在多種生物化學方法中的應用，并且驗證了其檢測不同hbv基因型的能力。單克隆抗體具有高效、廣譜性、多用途的特點，在hbv感染的診斷領域具有廣闊的應用前景。