背景技術(shù)：

1、因子viii是內(nèi)源性凝血級(jí)聯(lián)路徑的一種重要組分。在循環(huán)中，因子viii主要與血管性血友病因子(vonwillebrand?factor)復(fù)合。在由凝血酶(因子iia)活化后，它自復(fù)合物解離以與因子ixa在內(nèi)源性凝血級(jí)聯(lián)中相互作用，此又會(huì)活化因子x。一旦自血管性血友病因子復(fù)合物移除，活化的因子viii即由活化的蛋白質(zhì)c(apc)、因子xa及因子ixa蛋白水解失活，且自血流快速清除。當(dāng)與正常血管性血友病因子蛋白復(fù)合時(shí)，因子viii的半衰期是約12小時(shí)，而在不存在血管性血友病因子的情況下，因子viii的半衰期降低至2小時(shí)(tuddenhameg等，br?j?haematol.(1982)52(2)：259-267)。

2、在血友病中，血液凝結(jié)受缺乏某些血漿凝血因子干擾。甲型血友病是一種因子viii缺乏癥，且是一種占血友病病例的80％的隱性性連鎖x染色體病癥。管理甲型血友病的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)是用重組因子viii濃縮物進(jìn)行的補(bǔ)充療法?；加兄囟燃仔脱巡〉氖茉囌呔哂械陀谡Ｖ?-2％的循環(huán)促凝血因子viii水平，且通常采用目的在于保持在各劑量之間因子viii高于1％的防治性療法，此可通常通過(guò)一周給予因子viii兩至三次來(lái)達(dá)成?；加兄械戎囟妊巡?因子viii水平是正常值的2-5％)的人占25-30％的血友病事件且在輕微創(chuàng)傷之后顯現(xiàn)出血。患有輕度甲型血友病(因子viii水平是正常值的5-40％)的人占全部血友病事件的15-20％，且僅在重大創(chuàng)傷或手術(shù)之后發(fā)展出血。

3、外源供應(yīng)的因子viii的體內(nèi)活性受限于蛋白質(zhì)半衰期較短與結(jié)合因子viii且減弱或破壞止血功能的抑制劑兩者。

4、多達(dá)30％的接受外源供應(yīng)的因子viii的甲型血友病患者對(duì)因子viii發(fā)動(dòng)igg免疫反應(yīng)(towfighi，f.等comparative?measurement?of?anti-factor?viii?antibody?bybethesda?assay?and?elisa?reveals?restricted?isotype?profile?and?epitopespecificity.acta?haematol(2005)114：84-90)，此可導(dǎo)致完全抑制它的促凝血活性和/或促進(jìn)因子viii更快速清除(e等high?titerinhibitors?in?severe?haemophilia?a.ameta-analysis?based?on?eight?long-term?follow-up?studies?conceming?inhibitorsassociated?with?crude?or?intermediate?purity?factor?viiiproducts.throm.haemost.(1994)72：162-164)。稱為fviii抑制劑的igg抗體主要針對(duì)a2、a3及c2結(jié)構(gòu)域(scandella?d等localization?of?epitopes?for?human?factor?viiiinhibitor?antibodies?by?immunoblotting?and?antibody?neutralization.blood(1989)74：1618-1626)，但也可針對(duì)a1、b及c1結(jié)構(gòu)域來(lái)產(chǎn)生。因此，用于具有fviii抑制劑的患者的治療選項(xiàng)是有限的。

5、通常靜脈內(nèi)給予如因子viii的大型蛋白質(zhì)以使藥劑在血流中直接可用。先前已證明肌肉內(nèi)注射的未修飾因子viii產(chǎn)生的最大循環(huán)水平僅為正常血漿水平的1.4％(pool等，ineffectiveness?of?intramuscularly?injected?factor?viiiconcentrate?in?twohemophilic?patients.new?englandj.medicine(1966)275(10)：547-548)?？沙ㄟ^(guò)靜脈內(nèi)途徑以外施用的制劑將大大簡(jiǎn)化它們的使用，增加安全性，且導(dǎo)致大量成本節(jié)約。

6、對(duì)治療性蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾可改進(jìn)它的體內(nèi)清除速率及隨后血清半衰期。常見(jiàn)修飾的一個(gè)實(shí)例是添加聚乙二醇(peg)部分，其通常通過(guò)peg上的醛或n-羥基丁二酰亞胺(nhs)基團(tuán)與胺基團(tuán)(例如賴氨酸側(cè)鏈或n末端)反應(yīng)來(lái)偶聯(lián)于蛋白質(zhì)。然而，綴合步驟可導(dǎo)致形成需要提取、純化和/或其它進(jìn)一步過(guò)程的異質(zhì)產(chǎn)物混合物，所述所有過(guò)程都不可避免地影響產(chǎn)物產(chǎn)率及質(zhì)量控制。此外，如果在凝血因子的結(jié)合位點(diǎn)附近的氨基酸側(cè)鏈通過(guò)聚乙二醇化過(guò)程而變得被修飾，那么凝血因子的藥理學(xué)功能可受阻礙。其它方法包括使fc結(jié)構(gòu)域基因融合于治療性蛋白質(zhì)，此會(huì)增加治療性蛋白質(zhì)的尺寸，因此降低通過(guò)腎進(jìn)行清除的速率。在一些情況下，fc結(jié)構(gòu)域賦予結(jié)合fcrn受體，且通過(guò)fcrn受體自溶酶體再循環(huán)的能力，從而導(dǎo)致藥代動(dòng)力學(xué)半衰期增加。不幸的是，fc結(jié)構(gòu)域在重組表達(dá)期間不高效折疊，且傾向于形成稱為包涵體的不溶性沉淀。這些包涵體必須被溶解且功能性蛋白質(zhì)必須自錯(cuò)誤折疊的聚集體復(fù)性，此為一種耗時(shí)、低效且昂貴的過(guò)程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及新型凝血因子viii融合蛋白組合物及其用途。具體來(lái)說(shuō)，本文提供的組合物特別用于治療或改善與甲型血友病、因子viii缺乏癥、出血性病癥和凝血病變相關(guān)的病狀。在一方面，本發(fā)明提供包含因子viii(fviii)和一個(gè)或多個(gè)延伸重組多肽(xten)的分離的融合蛋白的組合物，其中所述融合蛋白展現(xiàn)促凝血活性。適用于構(gòu)建所述融合蛋白的主題xten通常是具有非重復(fù)序列和非結(jié)構(gòu)化構(gòu)象的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)xten連接于選自天然人因子viii、因子viii?b結(jié)構(gòu)域缺失序列(“fviii?bdd”)及其序列變體(全部前述各者總稱為“fviii”或“cf”)的凝血因子fviii(“cf”)，從而產(chǎn)生重組因子viii-xten融合蛋白(“cfxten”)。cfxten的因子viii多肽組分包含a1結(jié)構(gòu)域、a2結(jié)構(gòu)域、c1結(jié)構(gòu)域、c2結(jié)構(gòu)域和任選b結(jié)構(gòu)域或其部分。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)描繪以上提及的結(jié)構(gòu)域以包含酸性a1、a2和a3間隔子來(lái)進(jìn)一步表征fviii。在另一實(shí)施方案中，本公開(kāi)涉及包含融合蛋白的藥物組合物及其在用于治療因子viii相關(guān)病狀的方法和方案中的用途。cfxten組合物相較于未連接于xten的fviii具有增強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)，此可允許更便利的給藥和改進(jìn)功效。

2、在第一方面，本發(fā)明涉及包含因子viii多肽和一個(gè)或多個(gè)連接于所述因子viii的延伸重組多肽(xten)的重組因子viii融合蛋白。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含因子viii多肽和至少一個(gè)延伸重組多肽(xten)的重組因子viii融合蛋白，其中所述因子viii多肽包含含有a1酸性間隔子區(qū)域的a1結(jié)構(gòu)域、含有a2酸性間隔子區(qū)域的a2結(jié)構(gòu)域、含有a3酸性間隔子區(qū)域的a3結(jié)構(gòu)域、c1結(jié)構(gòu)域、c2結(jié)構(gòu)域和任選b結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，且其中所述至少一個(gè)xten在以下各處連接于所述因子viii多肽：(i)所述因子viii多肽的c末端；(ii)如果存在b結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，那么在所述因子viii多肽的b結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(iii)在所述因子viii多肽的所述a1結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(iv)在所述因子viii多肽的所述a2結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(v)在所述因子viii多肽的所述a3結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(vi)在所述因子viii多肽的所述c1結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(vii)在所述因子viii多肽的所述c2結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(viii)在所述因子viii多肽的n末端處，或(ix)在所述因子viii多肽的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間，其中相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii，當(dāng)通過(guò)體外凝血測(cè)定進(jìn)行測(cè)量時(shí)，所述融合蛋白保留至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％的促凝血活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，在前述重組因子viii融合蛋白中，至少一個(gè)xten在于選自表5、表6、表7、表8和表9的位點(diǎn)的1至6個(gè)氨基酸處或內(nèi)的位點(diǎn)處連接于所述因子viii多肽。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含因子viii多肽和至少第一延伸重組多肽(xten)的重組因子viii融合蛋白，其中所述因子viii多肽包含含有a1酸性間隔子區(qū)域的a1結(jié)構(gòu)域、含有a2酸性間隔子區(qū)域的a2結(jié)構(gòu)域、含有a3酸性間隔子區(qū)域的a3結(jié)構(gòu)域、c1結(jié)構(gòu)域、c2結(jié)構(gòu)域和任選b結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，且其中所述第一xten在以下各處連接于所述因子viii多肽：(i)所述因子viii多肽的c末端；(ii)如果存在所述b結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，那么在所述因子viii多肽的所述b結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(iii)在所述因子viii多肽的所述a1結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(iv)在所述因子viii多肽的所述a2結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(v)在所述因子viii多肽的所述a3結(jié)構(gòu)域內(nèi)；(vi)在所述因子viii多肽的所述c1結(jié)構(gòu)域內(nèi)；或(vii)在所述因子viii多肽的所述c2結(jié)構(gòu)域內(nèi)；且當(dāng)相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii蛋白時(shí)，所述融合蛋白(a)在本文所述的體外凝血測(cè)定或本領(lǐng)域中已知的其它此類測(cè)定中，保留至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％促凝血活性，和/或(b)在本文所述的體外結(jié)合測(cè)定或本領(lǐng)域中已知的其它此類測(cè)定中，展現(xiàn)與抗因子viii抗體的結(jié)合降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，在前述重組因子viii融合蛋白中，至少一個(gè)xten在于選自表5、表6、表7、表8和表9的位點(diǎn)的1至6個(gè)氨基酸處或內(nèi)的位點(diǎn)處連接于所述因子viii多肽。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含因子viii多肽和至少第一延伸重組多肽(xten)的重組因子viii融合蛋白，其中所述因子viii多肽包含含有a1酸性間隔子區(qū)域的a1結(jié)構(gòu)域、含有a2酸性間隔子區(qū)域的a2結(jié)構(gòu)域、含有a3酸性間隔子區(qū)域的a3結(jié)構(gòu)域、cl結(jié)構(gòu)域、c2結(jié)構(gòu)域和任選b結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，且其中所述第一xten在選自表6及表7的插入位點(diǎn)處連接于所述因子viii多肽且其中相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii蛋白，當(dāng)通過(guò)本文所述的體外凝血測(cè)定或本領(lǐng)域中已知的其它此類測(cè)定進(jìn)行測(cè)量時(shí)，所述融合蛋白保留至少約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％的促凝血活性。未連接于xten的因子viii蛋白的非限制性實(shí)例包括天然fviii、bdd?fviii、pbc100和來(lái)自表1的序列。在重組因子viii融合蛋白的另一實(shí)施方案中，當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，因子viii多肽與選自由以下組成的組的序列具有至少約80％序列同一性、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％或約99％至約100％序列同一性：表1的序列、圖3中描繪的序列和圖4中描繪的序列。在另一實(shí)施方案中，融合蛋白包含至少另一在所述因子viii多肽的c末端處或在所述因子viii多肽的b結(jié)構(gòu)域內(nèi)連接于所述因子viii多肽或任選置換所述因子viii多肽的b結(jié)構(gòu)域的xten。在一特定實(shí)施方案中，融合蛋白包含至少一個(gè)位于所述因子viii多肽的b結(jié)構(gòu)域內(nèi)或任選置換所述因子viii多肽的b結(jié)構(gòu)域的xten序列。在另一特定實(shí)施方案中，融合蛋白包含至少一個(gè)在所述因子viii多肽的c末端處連接于所述因子viii多肽的xten序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組因子viii融合蛋白包含人因子viii的b結(jié)構(gòu)域缺失的變體，其中關(guān)于如圖3中闡述的全長(zhǎng)人因子viii序列，所述b結(jié)構(gòu)域缺失自在約氨基酸殘基編號(hào)741至約750處的第一位置開(kāi)始且在于氨基酸殘基編號(hào)1635至約1648處的第二位置處結(jié)束。在另一實(shí)施方案中，重組因子viii融合蛋白包含在所述因子viii多肽的c末端處連接于所述因子viii多肽的第一xten序列，和在所述因子viii多肽的b結(jié)構(gòu)域內(nèi)或置換所述因子viii多肽的b結(jié)構(gòu)域的至少第二xten，其中關(guān)于如圖3中闡述的全長(zhǎng)人因子viii序列，所述第二xten連接于約氨基酸殘基編號(hào)741至約750的c末端和氨基酸殘基編號(hào)1635至約1648的n末端，其中所述xten的累積長(zhǎng)度是至少約100個(gè)氨基酸殘基。在一個(gè)實(shí)施方案中，在前述融合蛋白中，第二xten在n745至p1640之間、或在s743至q1638之間、或在p747至v1642之間、或在n745與q1656之間、或在n745與s1657之間、或在n745與t1667之間、或在n745與q1686之間、或在r747與v1642之間、或在t751與t1667之間連接因子viii氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組因子viii融合蛋白包含當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，相較于選自表21的具有類似長(zhǎng)度的序列具有至少約80％序列同一性、或至少約90％、或至少約91％、或至少約92％、或至少約93％、或至少約94％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％至約100％序列同一性的序列。在另一實(shí)施方案中，重組因子viii融合蛋白包含至少第二xten、任選第三xten、任選第四xten、任選第五xten和任選第六xten，其中所述第二、第三、第四、第五或第六xten各自在選自由以下組成的組的第二、第三、第四、第五或第六位點(diǎn)處連接于所述因子viii多肽：來(lái)自表5、表6、表7、表8和表9的插入位點(diǎn)；在成熟因子viii的氨基酸殘基32、220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910的6個(gè)氨基酸內(nèi)的位置；在所述因子viii多肽的任何兩個(gè)鄰近結(jié)構(gòu)域之間的位置，其中所述兩個(gè)鄰近結(jié)構(gòu)域選自由a1和a2結(jié)構(gòu)域、a2和b結(jié)構(gòu)域、b和a3結(jié)構(gòu)域、a3和c1結(jié)構(gòu)域、以及c1和c2結(jié)構(gòu)域組成的組；在所述因子viii多肽的b結(jié)構(gòu)域內(nèi)的位置，其中所述第二xten連接于天然因子viii序列的約氨基酸殘基編號(hào)741至約750的c末端和氨基酸殘基編號(hào)1635至約1648的n末端；和所述因子viii多肽的c末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一xten與第二xten相隔至少10個(gè)氨基酸、至少50個(gè)氨基酸、至少100個(gè)氨基酸、至少200個(gè)氨基酸、至少300個(gè)氨基酸或至少400個(gè)氨基酸。在包含至少第二xten、任選第三xten、任選第四xten、任選第五xten和任選第六xten的重組因子viii融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，各xten相較于選自由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列組成的組的具有類似長(zhǎng)度的xten，具有至少約80％序列同一性、或至少約90％、或至少約91％、或至少約92％、或至少約93％、或至少約94％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％、或約100％序列同一性。在重組因子viii融合蛋白的另一實(shí)施方案中，所述重組因子viii融合蛋白包含至少第二xten、任選第三xten、任選第四xten、任選第五xten和任選第六xten。在優(yōu)選實(shí)施方案中，當(dāng)向受試者施用時(shí)，重組因子viii融合蛋白展現(xiàn)終末半衰期至少約3小時(shí)、或4小時(shí)、或6小時(shí)、或12小時(shí)、或13小時(shí)、或14小時(shí)、或16小時(shí)、或24小時(shí)、或48小時(shí)、或72小時(shí)、或96小時(shí)、或120小時(shí)、或144小時(shí)、或7天、或14天、或21天，其中所述受試者選自人和因子viii/血管性血友病因子雙重敲除小鼠。另外，在這個(gè)段落的實(shí)施方案中，相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii，融合蛋白展現(xiàn)與抗因子viii抗體的結(jié)合降低或保留的促凝血活性更大或兩者。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)各自通過(guò)體外凝血測(cè)定加以測(cè)定時(shí)，相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii，在抗fviii抗體存在下，重組因子viii融合蛋白的促凝血活性大至少30％、或40％、50％、80％、100％、200％、300％、400％或500％。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用畢提斯達(dá)(bethesda)測(cè)定，利用選自由表10的抗體和來(lái)自具有因子viii抑制劑的甲型血友病患者的多克隆抗體組成的組的抗因子viii抗體測(cè)定融合蛋白與抗因子viii抗體的降低的結(jié)合，其中融合蛋白的結(jié)合降低和促凝血活性保留是由相較于未連接于xten的因子viii的畢提斯達(dá)效價(jià)，融合蛋白的畢提斯達(dá)效價(jià)降低至少約2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、100或200個(gè)畢提斯達(dá)單位所證明。

3、在一個(gè)實(shí)施方案中，重組因子viii融合蛋白可例如包含一個(gè)或多個(gè)xten，其中當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，所述xten相較于一個(gè)或多個(gè)選自表4、表13、表14、表15、表16和表17的具有類似長(zhǎng)度的xten具有至少約80％序列同一性、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％或約99％至約100％序列同一性。

4、在另一方面，本發(fā)明涉及包含呈特定n末端至c末端構(gòu)型的fviii和一個(gè)或多個(gè)xten的重組因子viii融合蛋白。在cfxten組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式i的重組因子viii融合蛋白：

5、(xten)x-cf-(xten)y???i

6、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，cf是如本文定義的因子viii，包括與來(lái)自表1的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于與表4中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列。因此，cfxten融合組合物可具有xten-cf、xten-cf-xten或cf-xten構(gòu)型。

7、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式ii的重組因子viii融合蛋白：

8、(xten)x-(s)x-(cf)-(xten)x????ii

9、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，cf是如本文定義的因子viii，包括與表1中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列；s是具有1個(gè)至約50個(gè)之間的氨基酸殘基的可任選包括可與限制位點(diǎn)相容的裂解序列或氨基酸的間隔子序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于與表4中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列。

10、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組因子viii融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式iii：

11、(xten)x-(s)x-(cf)-(s)y-(xten)y??iii

12、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，cf是如本文定義的因子viii，包括與表1中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列；s是具有1個(gè)至約50個(gè)之間的氨基酸殘基的可任選包括可與限制位點(diǎn)相容的裂解序列或氨基酸的間隔子序列；x是0或1且y是0或1，其中x+y≥1；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于與表4中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列。

13、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式iv的重組因子viii融合蛋白：

14、(a1)-(xten)u-(a2)-(xten)v-(b)-(xten)w-(a3)-(xten)x-(c1)-(xten)y-(c2)-(xten)z

15、iv

16、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，a1是fviii的a1結(jié)構(gòu)域；a2是fviii的a2結(jié)構(gòu)域；a3是fviii的a3結(jié)構(gòu)域；b是fviii的b結(jié)構(gòu)域，其可為所述b結(jié)構(gòu)域的片段或剪接變體；c1是fviii的c1結(jié)構(gòu)域；c2是fviii的c2結(jié)構(gòu)域；v是0或1；w是0或1；x是0或1；y是0或1；y是0或1，前提是u+v+x+y+z≥1；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于與表4中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列。

17、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式v的重組因子viii融合蛋白：

18、(xten)1-(s)a-(a1)-(s)b-(xten)o-(s)b-(a2)-(s)c-(xten)v-(s)c-(b)-(s)d-(xten)w-(s)d-(a3)-(s)e-(xten)x-(s)e-(c1)-(s)f-(xten)y-(s)f-(c2)-(s)g-(xten)2??v

19、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，a1是fviii的a1結(jié)構(gòu)域；a2是fviii的a2結(jié)構(gòu)域；a3是fviii的a3結(jié)構(gòu)域；b是fviii的b結(jié)構(gòu)域，其可為所述b結(jié)構(gòu)域的片段或剪接變體；c1是fviii的c1結(jié)構(gòu)域；c2是fviii的c2結(jié)構(gòu)域；s是具有1個(gè)至約50個(gè)之間的氨基酸殘基的可任選包括可與限制位點(diǎn)相容的裂解序列或氨基酸的間隔子序列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f是0或1；g是0或1；t是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1；y是0或1；z是0或1，前提是t+u+v+w+x+y+z≥1；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于與表4中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列。在式v的另一實(shí)施方案中，間隔子序列是甘氨酸或選自表11和12的序列。

20、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式vi的重組因子viii融合蛋白：

21、(xten)u-(s)a-(a1)-(s)b-(xten)v-(s)b-(a2)-(s)c-(xten)w-(s)c-(a3)-(s)d-(xten)c-(s)d-(c1)-(s)c-(xten)y-(s)c-(c2)-(s)f-(xten)z??vi

22、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，a1是fviii的a1結(jié)構(gòu)域；a2是fviii的a2結(jié)構(gòu)域；a3是fviii的a3結(jié)構(gòu)域；c1是fviii的c1結(jié)構(gòu)域；c2是fviii的c2結(jié)構(gòu)域；s是具有1個(gè)至約50個(gè)之間的氨基酸殘基的可任選包括可與限制位點(diǎn)相容的裂解序列或氨基酸的間隔子序列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1；y是0或1；z是0或1，前提是u+v+w+x+y+z≥1；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于與表4中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列。在式v的另一實(shí)施方案中，間隔子序列是甘氨酸或選自表11和12的序列。

23、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式vii的重組因子viii融合蛋白：

24、(sp)-(xten)x-(cs)x-(s)x-(fviii_1-745)-(s)y-(xten)y-(s)y-(fviii_1640-2332)-(s)z-(cs)z-(xten)z??vii

25、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，sp是信號(hào)肽，優(yōu)選具有序列mqielstcfflcllrfcfs(seqid?no：1611)，cs是表12中所列的裂解序列，s是具有1個(gè)至約50個(gè)之間的氨基酸殘基的可任選包括可與限制位點(diǎn)相容的氨基酸的間隔子序列，“fviii?1-745”是因子fviii的殘基1-745且“fviii_1640-2332”是fviii的殘基1640-2332，x是0或1，y是0或1，且z是0或1，其中x+y+z>2；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于與表4中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列。在式vii的一個(gè)實(shí)施方案中，間隔子序列是gpegps(seq?id?no：1612)。在式v的另一實(shí)施方案中，間隔子序列是甘氨酸或選自表11和12的序列。

26、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式viii重組因子viii融合蛋白：

27、(a1)-(s)a-(xten)v-(s)a-(a2)-(b1)-(s)b-(xten)w-(s)b-(b2)-(a3)-(s)c-(xten)x-(s)c-(c1)-(s)d-(xten)y-(s)d-(c2)-(s)e-(xten)2??viii

28、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，a1是fviii的a1結(jié)構(gòu)域；a2是fviii的a2結(jié)構(gòu)域；b1是b結(jié)構(gòu)域的可具有fviii的殘基741至743-750或者fviii的約殘基741至約殘基745的片段；b2是b結(jié)構(gòu)域的可具有fviii的殘基1635-1686至1689或者fviii的約殘基1640至約殘基1689的片段；a3是fviii的a3結(jié)構(gòu)域；c1是fviii的c1結(jié)構(gòu)域；c2是fviii的c2結(jié)構(gòu)域；s是具有1個(gè)至約50個(gè)之間的氨基酸殘基的可任選包括可與限制位點(diǎn)相容的裂解序列或氨基酸的間隔子序列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1；y是0或1；z是0或1，前提是u+v+w+x+y+z≥1；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于與表4中闡述的序列具有至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％或100％序列同一性的序列。在式viii的一個(gè)實(shí)施方案中，間隔子序列是gpegps(seq?id?no：1612)。在式v的另一實(shí)施方案中，間隔子序列是甘氨酸或選自表11和12的序列。

29、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式ix的重組因子viii融合蛋白：

30、(a1n)-(s)a-(xten)t-(s)b-(a1c)-(a2n)-(s)c-(xten)u-(s)d-(a2c)-(bn)-(s)e-(xten)v-(s)t-(bc)-(a3n)-(s)g-(xten)w-(s)h-(a3c)-(c1n)-(s)i-(xten)x-(s)j-(c1c)-(c2n)-(s)k-(xten)y-(s)-(c2c)-(s)m-(xten)x

31、ix

32、其中就各次出現(xiàn)獨(dú)立而言，a1n是a1結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)1(相對(duì)于天然成熟fviii加以編號(hào))至至多殘基編號(hào)371的片段，a1c是a1結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)2至至多殘基編號(hào)372的片段，前提是所述a1n片段的序列在所述a1c片段中不重復(fù)；a2n是a2結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)373至至多殘基編號(hào)739的片段，a2c是a2結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)374至至多殘基編號(hào)740的片段，前提是所述a2n片段的序列在所述a2c片段中不重復(fù)；bn是b結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)741至至多殘基編號(hào)1647的片段，bc是b結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)742至至多殘基編號(hào)1648的片段，前提是所述bn片段的序列在所述bc片段中不重復(fù)；a3n是a3結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)1649至至多殘基編號(hào)2019的片段，a3c是a3結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)1650至至多殘基編號(hào)2019的片段，前提是所述a3n片段的序列在所述a3c片段中不重復(fù)；c1n是c1結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)2020至至多殘基編號(hào)2171的片段，c1c是c1結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)2021至至多殘基編號(hào)2172的片段，前提是所述c1n片段的序列在所述c1c片段中不重復(fù)；c2n是c2結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)2173至至多殘基編號(hào)2331的片段，c2c是c2結(jié)構(gòu)域的自至少殘基編號(hào)2174至至多殘基編號(hào)2332片段，前提是所述c2n片段的序列在所述c2c片段中不重復(fù)；s是具有1個(gè)至約50個(gè)之間的氨基酸殘基的可任選包括可與限制位點(diǎn)相容的裂解序列或氨基酸的間隔子序列；a是0或1；b是0或1；c是0或1；d是0或1；e是0或1；f是0或1；g是0或1；h是0或1；i是0或1；j是0或1；k是0或1；1是0或1；m是0或1；t是0或1；u是0或1；v是0或1；w是0或1，x是0或1；y是0或1；z是0或1，前提是t+u+v+w+x+y+z≥1；且xten是如本文所述的延伸重組多肽，包括但不限于相較于一個(gè)或多個(gè)選自表4的具有類似長(zhǎng)度的xten，具有至少約80％序列同一性、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％或約99％至約100％序列同一性的序列。在式ix的一個(gè)實(shí)施方案中，間隔子序列是gpegps(seq?id?no：1612)。在式v的另一實(shí)施方案中，間隔子序列是甘氨酸或選自表11和12的序列。在式ix的另一實(shí)施方案中，z是1。在式ix的融合蛋白的另一實(shí)施方案中，v是1且關(guān)于如圖3中闡述的全長(zhǎng)人因子viii序列，xten連接于約氨基酸殘基編號(hào)741至約750的c末端和氨基酸殘基編號(hào)1635至約1648的n末端。在式ix的融合蛋白的另一實(shí)施方案中，t、u、v、w、x、y和z的總和等于2、3、4、5或6。在式ix的另一實(shí)施方案中，t、u、v、w、x、y和z的總和等于2，且v是1且z是1。在式ix的融合蛋白的另一實(shí)施方案中，t、u、v、w、x、y和z的總和等于3，v和z各自等于1，且t、u、w、x或y的任一者是1。在式ix的另一實(shí)施方案中，t、u、v、w、x、y和z的總和等于4，v和w和z各自等于1，且t、u、x或y的兩者是1。在式的ix融合蛋白的另一實(shí)施方案中，xten的累積長(zhǎng)度在約84個(gè)至約3000個(gè)氨基酸殘基之間。在式ix的另一實(shí)施方案中，至少一個(gè)xten是緊靠對(duì)應(yīng)于成熟天然人因子viii中選自由以下組成的組的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸殘基編號(hào)32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910。在式ix的融合蛋白的另一實(shí)施方案中，各xten在選自表5、表6、表7、表8和表9的位點(diǎn)處連接于所述融合蛋白。在式ix的融合蛋白的另一實(shí)施方案中，當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，各xten相較于選自由表4、表13、表14、表15、表16和表17中的序列組成的組的具有類似長(zhǎng)度的xten具有至少約80％、或約90％、或至少約91％、或至少約92％、或至少約93％、或至少約94％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％、或約100％序列同一性。

33、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式x的第一重組因子viii多肽：

34、(a1)-a1-(a2)-a2-[b]??x

35、和一種包含式xi的第二多肽：

36、a3-(a3)-(c1)-(c2)??xi

37、其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以異二聚體形式存在；其中a1是因子viii的a1結(jié)構(gòu)域；a2是因子viii的a2結(jié)構(gòu)域；[b]是因子viii的b結(jié)構(gòu)域、其片段或被缺失；a3是因子viii的a3結(jié)構(gòu)域；c1是因子viii的c1結(jié)構(gòu)域；c2是因子viii的c2結(jié)構(gòu)域；a1、a2和a3是酸性間隔子區(qū)域；其中所述a1結(jié)構(gòu)域包含xten容許環(huán)-1(a1-1)區(qū)域和xten容許環(huán)-2(a1-2)區(qū)域；其中所述a2結(jié)構(gòu)域包含xten容許環(huán)-1(a2-1)區(qū)域和xten容許環(huán)-2(a2-2)區(qū)域；其中所述a3結(jié)構(gòu)域包含xten容許環(huán)-1(a3-1)區(qū)域和xten容許環(huán)-2(a3-2)區(qū)域；其中xten序列插入?yún)^(qū)域a1-1、a1-2、a2-1、a2-2、a3-1或a3-2的至少一者中；且其中所述重組因子viii蛋白展現(xiàn)促凝血活性。在異二聚體的一個(gè)實(shí)施方案中，第一多肽和第二多肽形成包含式(a1)-a1-(a2)-a2-[b]-[a3]-(a3)-(c1)-(c2)的單一多肽鏈。在一個(gè)前述實(shí)施方案中，“融合”是指肽鍵。

38、在cfxten組合物的另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種式x的第一重組因子viii多肽：

39、(a1)-a1-(a2)-a2-[b]??x

40、和一種包含式xi的第二多肽：

41、33-(a3)-(c1)-(c2)??xi

42、其中所述第一多肽和所述第二多肽融合或以異二聚體形式存在；其中a1是因子viii的a1結(jié)構(gòu)域；a2是因子viii的a2結(jié)構(gòu)域；[b]是因子viii的b結(jié)構(gòu)域、其片段或被缺失；a3是因子viii的a3結(jié)構(gòu)域；c1是因子viii的c1結(jié)構(gòu)域；c2是因子viii的c2結(jié)構(gòu)域；a1、a2和a3是酸性間隔子區(qū)域；其中xten序列插入a3中；且其中所述重組因子viii蛋白展現(xiàn)促凝血活性。在異二聚體的一個(gè)實(shí)施方案中，第一多肽和第二多肽形成包含式(a1)-a1-(a2)-a2-[b]-[a3]-(a3)-(c1)-(c2)的單一多肽鏈。在一個(gè)前述實(shí)施方案中，“融合”是指肽鍵。

43、在前述式x和xi多肽的實(shí)施方案中，xten容許環(huán)包含在表面暴露的可撓性環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)，且其中根據(jù)以dssp數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)2r7e儲(chǔ)存的成熟因子viii的二級(jí)結(jié)構(gòu)，a1-1位于β鏈1與β鏈2之間，a1-2位于β鏈11與β鏈12之間，a2-l位于β鏈22與β鏈23之間，a2-2位于β鏈32與β鏈33之間，a3-1位于β鏈38與β鏈39之間且a3-2位于β鏈45與β鏈46之間。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，包含a1-1的表面暴露的可撓性環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸15至約氨基酸45的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，a1-1對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸18至約氨基酸41的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，包含a1-2的表面暴露的可撓性環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸201至約氨基酸232的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，a1-2對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸218至約氨基酸229的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，包含a2-1的表面暴露的可撓性環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸395至約氨基酸421的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，a2-1對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸397至約氨基酸418的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，包含a2-2的表面暴露的可撓性環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸577至約氨基酸635的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，a2-2對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸595至約氨基酸607的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，包含a3-1的表面暴露的可撓性環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸1705至約氨基酸1732的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，a3-1對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸1711至約氨基酸1725的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，包含a3-2的表面暴露的可撓性環(huán)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于天然人成熟人因子viii中自約氨基酸1884至約氨基酸1917的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，a3-2對(duì)應(yīng)于天然成熟人因子viii中自約氨基酸1899至約氨基酸1911的區(qū)域。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，xten序列插入?yún)^(qū)域a1-1、a1-2、a2-1、a2-2、a3-1或a3-2的至少兩者中。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，xten序列是緊靠對(duì)應(yīng)于成熟天然人因子viii中選自由以下組成的組的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸殘基編號(hào)32、220、224、336、339、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，另一xten序列插入a3酸性間隔子區(qū)域中。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，另一xten序列插入緊靠對(duì)應(yīng)于氨基酸1656的氨基酸的下游的a3酸性間隔子中。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，a1結(jié)構(gòu)域包含xten容許環(huán)-1(a1-1)區(qū)域和xten容許環(huán)-2(a1-2)區(qū)域，其中a2結(jié)構(gòu)域包含xten容許環(huán)-1(a2-1)區(qū)域和xten容許環(huán)-2(a2-2)區(qū)域，且其中a3結(jié)構(gòu)域包含xten容許環(huán)-1(a3-1)區(qū)域和xten容許環(huán)-2(a3-2)區(qū)域，且其中另一xten序列插入?yún)^(qū)域a1-1、a1-2、a2-1、a2-2、a3-1或a3-2的至少一者中。在前述式x和xi多肽的其它實(shí)施方案中，另一xten序列是緊靠對(duì)應(yīng)于成熟天然人因子viii中選自由以下組成的組的氨基酸的氨基酸的下游插入：氨基酸殘基編號(hào)32、220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910。在式x和xi多肽的前述實(shí)施方案中，融合蛋白展現(xiàn)未連接于xten的相應(yīng)因子viii的促凝血活性的至少約30％、40％、50％、60％、70％或80％或90％，其中所述促凝血活性是通過(guò)體外凝血測(cè)定加以測(cè)定。

44、在所有實(shí)施方案中，當(dāng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中表達(dá)且通過(guò)體外凝血測(cè)定加以測(cè)定時(shí)，多肽可例如展現(xiàn)體外促凝血活性超過(guò)0.5iu/ml或1.0或1.5或2.0iu/ml。促凝血活性可通過(guò)顯色測(cè)定、單級(jí)凝結(jié)測(cè)定(例如aptt)或兩者測(cè)量。

45、在一些實(shí)施方案中，其中重組因子viii融合蛋白包含因子viii以及至少第一和第二xten，所述至少第一xten與所述至少第二xten相隔至少10個(gè)氨基酸、至少50個(gè)氨基酸、至少100個(gè)氨基酸、至少200個(gè)氨基酸、至少300個(gè)氨基酸或至少400個(gè)氨基酸。

46、在優(yōu)選實(shí)施方案中，重組因子viii融合蛋白包含因子viii以及至少第一xten和任選至少第二、或任選至少第三、或任選至少第四xten，所述融合蛋白相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii展現(xiàn)與抗因子viii抗體的結(jié)合降低?？审w內(nèi)或通過(guò)體外測(cè)定評(píng)估降低的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，體外測(cè)定是elisa測(cè)定，其中相較于未連接于xten的fviii，抗fviii抗體與融合蛋白的結(jié)合降低至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或至少約40％或更多。在另一實(shí)施方案中，體外測(cè)定是畢提斯達(dá)測(cè)定，其中融合蛋白的結(jié)合降低是由相較于未連接于xten的因子viii的畢提斯達(dá)效價(jià)，融合蛋白的畢提斯達(dá)效價(jià)降低至少約2、4、6、8、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、100或200個(gè)畢提斯達(dá)單位所證明。在體外測(cè)定中，抗因子viii抗體選自表10的抗體和來(lái)自具有因子viii抑制劑的甲型血友病患者的多克隆抗體。在展現(xiàn)與因子viii抑制劑抗體的結(jié)合降低的包含因子viii以及至少第一和第二xten的重組因子viii融合蛋白的特定實(shí)施方案中，所述第一xten在所述因子viii多肽的c2結(jié)構(gòu)域內(nèi)連接于所述因子viii多肽，且所述第二xten在所述因子viii多肽的a1或a2結(jié)構(gòu)域內(nèi)連接于所述因子viii多肽，其中相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii，所述融合蛋白展現(xiàn)與因子viii抑制劑抗體的結(jié)合降低，其中所述因子viii抑制劑抗體能夠結(jié)合位于所述a1、a2或c2結(jié)構(gòu)域內(nèi)的表位，且此外，其中所述融合蛋白展現(xiàn)促凝血活性。在前述融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，第二xten在因子viii多肽的a2結(jié)構(gòu)域內(nèi)連接于所述因子viii多肽且因子viii抑制劑抗體結(jié)合因子viii多肽的a2結(jié)構(gòu)域。在前述融合蛋白的另一實(shí)施方案中，第二xten在因子viii多肽的c2結(jié)構(gòu)域內(nèi)連接于所述因子viii多肽且因子viii抑制劑抗體結(jié)合因子viii多肽的c2結(jié)構(gòu)域。相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii，當(dāng)通過(guò)elisa測(cè)定加以測(cè)定時(shí)，抗因子viii抗體與融合蛋白的結(jié)合降低至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％，其中所述抗因子viii抗體選自由表10中的抗體和來(lái)自具有因子viii抑制劑的甲型血友病受試者的多克隆抗體組成的組。前述融合蛋白可進(jìn)一步包含至少三個(gè)xten，其中至少第三xten在選自以下的位點(diǎn)處連接于因子viii：在b結(jié)構(gòu)域內(nèi)或置換b結(jié)構(gòu)域、在c末端處、以及在選自表7或表9的插入位點(diǎn)的1、2、3、4、5或6個(gè)氨基酸處或內(nèi)。在與抗因子viii抗體的結(jié)合降低的實(shí)施方案中，相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii，當(dāng)通過(guò)體外凝血測(cè)定(例如顯色或單級(jí)凝結(jié)測(cè)定)加以測(cè)定時(shí)，融合蛋白在抗fviii抗體存在下的促凝血活性大至少10％、20％、30％、40％、50％、80％、100％、200％、300％、400％或500％或更多。

47、在所有實(shí)施方案中，融合蛋白的xten的特征可例如在于xten包含至少36、或至少42、或至少72、或至少96、或至少144、或至少288、或至少400、或至少500、或至少576、或至少600、或至少700、或至少800、或至少864、或至少900、或至少1000、或至少2000至約3000個(gè)氨基酸殘基或甚至更多殘基；甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)殘基的總和占xten的總氨基酸殘基的至少約80％、或至少約90％、或至少約95％、或至少約96％、或至少約97％、或至少約98％、或至少約99％；xten大致上是非重復(fù)的以致(i)xten不含有三個(gè)相同連續(xù)氨基酸，除非氨基酸是絲氨酸；(ii)至少約80％的xten序列由非重疊序列基序組成，所述序列基序各自包含約9至約14、或約12個(gè)由四至六個(gè)選自甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、絲氨酸(s)、蘇氨酸(t)、谷氨酸(e)和脯氨酸(p)的氨基酸組成的氨基酸殘基，其中在各非重疊序列基序中，任何兩個(gè)連續(xù)氨基酸殘基都不出現(xiàn)超過(guò)兩次；或(iii)xten序列的子序列計(jì)分小于10；xten具有大于90％、或大于95％、或大于99％無(wú)規(guī)卷曲形成率(如通過(guò)gor算法所確定)；xten具有小于2％α螺旋和2％β折疊(如通過(guò)chou-fasman算法所確定)；當(dāng)通過(guò)tepitope算法分析時(shí)，xten缺乏預(yù)測(cè)的t細(xì)胞表位，其中關(guān)于通過(guò)所述算法進(jìn)行所述預(yù)測(cè)的tepitope閾值計(jì)分的閾值是-9，且其中所述融合蛋白展現(xiàn)終末半衰期長(zhǎng)于至少約12小時(shí)、或至少約24小時(shí)、或至少約48小時(shí)、或至少約72小時(shí)、或至少約96小時(shí)、或至少約120小時(shí)、或至少約144小時(shí)、或至少約21天或更長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，重組因子viii融合蛋白包含可與另一xten相同或不同的至少第二、或至少第三、或至少第四xten。根據(jù)一種不同方法，當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，cfxten融合蛋白的至少一個(gè)、至少第二、或至少第三、或至少第四xten相較于一個(gè)或多個(gè)選自表4、表13、表14、表15、表16和表17的具有類似長(zhǎng)度的xten各自具有至少約80％序列同一性、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％或約99％至約100％序列同一性。在另一不同方法中，cfxten融合蛋白的至少一個(gè)、至少第二、或至少第三、或至少第四xten相較于選自以下的序列各自具有至少90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％、或約99％至約100％序列同一性：ae42_1、ae42_2、ae42_3、ag42_1、ag42_2、ag42_3、ag42_4、ae144_1a、ae144_2a、ae144_2b、ae144_3a、ae144_3b、ae144_4a、ae144_4b、ae144_5a、ae144_6b、ag144_1、ag144_2、ag144_a、ag144_b、ag144_c、ag144_f、ag144_3、ag144_4、ae288_1、ae288_2、ag288_1和ag288_2。

48、在一個(gè)實(shí)施方案中，cfxten重組因子viii融合蛋白的因子viii組分包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)選自相對(duì)于成熟人因子viii編號(hào)的殘基r1648、y1680和r1689的氨基酸取代，其中所述取代選自丙氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸。所述取代的非限制性實(shí)例包括r1648a、y1680f和r1689a。

49、在另一實(shí)施方案中，當(dāng)通過(guò)尺寸排阻色譜或類似方法測(cè)量時(shí)，cfxten融合蛋白展現(xiàn)表觀分子量因子至少約1.3、或至少約2、或至少約3、或至少約4、或至少約5、或至少約6、或至少約7、或至少約8、或至少約9、或至少約10。

50、在cfxten融合蛋白的一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)xten將通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)各自可由選自由因子xia、因子xiia、激肽釋放酶(kallikrein)、因子viia、因子ixa、因子xa、因子iia(凝血酶)、彈性蛋白酶-2(elastase-2)、mmp-12、mmp13、mmp-17和mmp-20組成的組的哺乳動(dòng)物蛋白酶裂解的裂解序列連接于fviii，其中由所述哺乳動(dòng)物蛋白酶在所述裂解序列處進(jìn)行的裂解使因子viii序列自xten序列釋放，且其中釋放的因子viii序列相較于未裂解融合蛋白展現(xiàn)促凝血活性增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，裂解序列可由因子xia裂解。

51、根據(jù)一種不同方法，cfxten融合蛋白包含至少三個(gè)位于因子viii多肽的不同位置處的xten，其中所述不同位置選自：在來(lái)自選自表5、表6、表7、表8和表9的位點(diǎn)的1至6個(gè)氨基酸處或內(nèi)的插入位置；在成熟因子viii的氨基酸殘基32、220、224、336、339、390、399、416、603、1656、1711、1725、1905和1910的1至6個(gè)氨基酸處或內(nèi)的位置；在因子viii序列中任何兩個(gè)鄰近結(jié)構(gòu)域之間的位置，其中所述兩個(gè)鄰近結(jié)構(gòu)域選自由a1和a2、a2和b、b和a3、a3和c1、以及c1和c2組成的組；關(guān)于如圖3中闡述的全長(zhǎng)人因子viii序列，在自在約氨基酸殘基編號(hào)741至約750處的第一位置開(kāi)始且在于氨基酸殘基編號(hào)1635至約1648處的第二位置處結(jié)束的內(nèi)部b結(jié)構(gòu)域缺失內(nèi)的位置；和因子viii序列的c末端，其中多個(gè)xten的累積長(zhǎng)度是至少約100至約3000個(gè)氨基酸殘基且其中融合蛋白相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii保留至少約30％、或約40％、或約50％、或約60％、或約70％、或約80％、或約90％的促凝血活性，其中促凝血活性是通過(guò)體外凝血測(cè)定加以測(cè)定。在一個(gè)前述實(shí)施方案中，當(dāng)向受試者施用時(shí)，融合蛋白相較于缺乏所述xten的相應(yīng)因子viii多肽展現(xiàn)終末半衰期延長(zhǎng)，其中當(dāng)向受試者施用時(shí)，所述融合蛋白展現(xiàn)終末半衰期至少約3小時(shí)、或4小時(shí)、或6小時(shí)、或12小時(shí)、或13小時(shí)、或14小時(shí)、或16小時(shí)、或24小時(shí)、或48小時(shí)、或72小時(shí)、或96小時(shí)、或120小時(shí)、或144小時(shí)、或7天、或14天、或21天。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試者選自由人和因子viii/血管性血友病因子雙重敲除小鼠組成的組。在一個(gè)前述實(shí)施方案中，融合蛋白不包含選自gtpgsgtasssp(seq?id?no：31)、gsstpsgatgsp(seq?id?no：32)、gsspsastgtgp(seq?id?no：33)、gaspgtsstgsp(seq?id?no：34)和

52、gsepatsgsetpgtsesatpesgpgsepatsgsetpgspagsptsteegtstepsegsapgsepatsgsetpgsepatsgsetpgsepatsgsetpgtstepsegsapgtsesatpesgpgsepatsgsetpgtstepsegsap(seq?id?no：59)的序列。在另一前述實(shí)施方案中，融合蛋白不含有由

53、gsepatsgsetpgtsesatpesgpgsepatsgsetpgspagsptsteegtstepsegsapgsepatsgsetpgsepatsgsetpgsepatsgsetpgtstepsegsapgtsesatpesgpgsepatsgsetpgtstepsegsap(seq?id?no：59)、

54、pgsspsastgtgpgsspsastgtgpgtpgsgtassspgsstpsgatgspgsspsastgtgpgaspgtsstgspgtpgsgtassspgsstpsgatgspgtpgsgtassspgaspgtsstgspgaspgtsstgspgtpgsgtasss(seq?id?no：71)或

55、pgaspgtsstgspgaspgtsstgspgtpgsgtassspgsstpsgatgspgtpgsgtassspgsstpsgatgspgtpgsgtassspgsstpsgatgspgsstpsgargspgsspsastgtgpgsspsastgtgpgaspgtsstgspgtpgsgtassspgsstpsgatgspgsspsastgtgpgsspsastgtgpgaspgtsstgspgaspgtsstgspgsstpsgatgspgsspsastgtgpgaspgtsstgspgsspsastgtgpgtpgsgtassspgsstpsgatgs(seq?idno：80)組成的xten序列。

56、在另一方面，本發(fā)明涉及相較于未連接于xten的fviii具有增強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，包括提高的參數(shù)的cfxten融合蛋白，其中所述增強(qiáng)的性質(zhì)包括但不限于相較于未連接于xten的fviii，終末半衰期變長(zhǎng)、曲線下面積變大、血液濃度保持在治療窗內(nèi)的時(shí)間增加、導(dǎo)致血液濃度在治療窗內(nèi)的連續(xù)劑量之間的時(shí)間增加、以及以iu計(jì)的可施用的劑量隨時(shí)間降低，但仍然導(dǎo)致血液濃度高于為促凝血作用所需的閾值濃度。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)向受試者施用時(shí)，cfxten融合蛋白相較于缺乏所述xten的相應(yīng)因子viii多肽展現(xiàn)終末半衰期延長(zhǎng)。受試者可為人或小鼠，如因子viii/血管性血友病因子雙重敲除小鼠。在一個(gè)前述實(shí)施方案中，當(dāng)向受試者施用時(shí)，相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii，cfxten展現(xiàn)終末半衰期長(zhǎng)至少約2倍、或約3倍、或約4倍、或約5倍、或約10倍、或約20倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)向受試者施用時(shí)，cfxten融合蛋白展現(xiàn)終末半衰期至少約3小時(shí)、或4小時(shí)、或6小時(shí)、或12小時(shí)、或13小時(shí)、或14小時(shí)、或16小時(shí)、或24小時(shí)、或48小時(shí)、或72小時(shí)、或96小時(shí)、或120小時(shí)、或144小時(shí)、或7天、或14天、或21天。在其它實(shí)施方案中，實(shí)施方案的融合蛋白的增強(qiáng)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)是相較于未連接于xten且以類似劑量向受試者施用的相應(yīng)fviii，維持有需要的受試者中的促凝血融合蛋白的循環(huán)血液濃度高于0.01iu/ml、或0.05iu/ml、或0.1iu/ml、或0.2iu/ml、或0.3iu/ml、或0.4iu/ml或0.5iu/ml的閾值濃度持續(xù)的時(shí)期長(zhǎng)至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約8倍、或至少約10倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60倍的性質(zhì)。半衰期和高于閾值濃度花費(fèi)的時(shí)間的增加允許相較于未連接于xten的相應(yīng)fviii，降低給藥頻率以及降低向受試者施用的融合蛋白(以摩爾當(dāng)量計(jì))的量。在一個(gè)實(shí)施方案中，相較于未連接于xten且使用類似劑量方案向受試者施用的相應(yīng)fviii，使用治療有效劑量方案向受試者施用主題融合蛋白導(dǎo)致融合蛋白的血液水平的至少兩個(gè)連續(xù)cmax峰值和/或cmin谷底值之間的時(shí)間增加至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少8倍、或至少10倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60倍或更高。

57、在優(yōu)選實(shí)施方案中，cfxten融合蛋白相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii保留至少約30％、或約40％、或約50％、或約60％、或約70％、或約80％、或約90％的促凝血活性，其中促凝血活性是通過(guò)體外凝血測(cè)定，如但不限于顯色測(cè)定或單級(jí)或兩級(jí)凝結(jié)測(cè)定加以測(cè)定。

58、根據(jù)一種不同方法，本發(fā)明提供包含因子viii多肽和至少一個(gè)延伸重組多肽(xten)的重組因子viii融合蛋白，其中所述因子viii多肽包含a1結(jié)構(gòu)域、a2結(jié)構(gòu)域、a3結(jié)構(gòu)域、c1結(jié)構(gòu)域、c2結(jié)構(gòu)域和任選b結(jié)構(gòu)域的全部或一部分，且其中所述至少一個(gè)xten在選自殘基編號(hào)18-32、或40、或211-224、或336-403、或599、或745-1640、或1656-1728、或1796-1804、或1900-1912、或2171-2332的插入位點(diǎn)處連接于所述因子viii多肽；且其中所述融合蛋白相較于未連接于xten的相應(yīng)因子viii保留至少約30％、或約40％、或約50％、或約60％、或約70％、或約80％、或約90％的促凝血活性。在一個(gè)前述實(shí)施方案中，融合蛋白包含至少第二xten、或至少第三、或至少第四xten，其中所述xten在于選自表5、表6、表7、表8和表9的位點(diǎn)的1至6個(gè)氨基酸處或內(nèi)的位點(diǎn)處連接于因子viii。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種重組因子viii融合蛋白，其進(jìn)一步包含在選自表5、表6、表7、表8、表9的插入位點(diǎn)處、在于來(lái)自圖8的一個(gè)或多個(gè)插入位置處的插入位置的n末端或c末端側(cè)的6個(gè)氨基酸處或內(nèi)、以及在一個(gè)或多個(gè)來(lái)自圖9的插入范圍內(nèi)連接于所述fviii多肽的至少第二xten、或至少第三、或至少第四xten，其中至少兩個(gè)xten由具有至少100至約400個(gè)氨基酸的氨基酸序列分隔。

59、本發(fā)明提供cfxten，其中xten的xten半徑比率是至少2.3或至少2.5，且由具有至少約20個(gè)氨基酸殘基、或至少約50、或至少約100、或至少約200、或至少約300、或至少約400個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列分隔。在其它實(shí)施方案中，cfxten包含至少四個(gè)xten，其中所述xten的xten半徑比率是至少2.3、或至少2.5、或至少2.8，且其中四個(gè)xten中連接于融合蛋白的至少三者由具有至少約20個(gè)氨基酸殘基、或至少約50、或至少約100、或至少約200、或至少約300、或至少約400個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列分隔，且第四xten連接在b結(jié)構(gòu)域(或其片段)內(nèi)或在c結(jié)構(gòu)域(或其末端)內(nèi)。

60、在一些實(shí)施方案中，主題組合物被構(gòu)造來(lái)相較于未連接于xten的相應(yīng)fviii，對(duì)受試者中的清除受體具有降低的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，cfxten融合蛋白展現(xiàn)對(duì)fviii的清除受體的結(jié)合親和力在未連接于xten的相應(yīng)fviii的結(jié)合親和力的約0.01％-30％、或約0.1％至約20％、或約1％至約15％、或約2％至約10％的范圍內(nèi)。在另一實(shí)施方案中，相較于未連接于xten的相應(yīng)fviii，對(duì)清除受體的親和力降低的融合蛋白的主動(dòng)清除降低且半衰期相應(yīng)增加長(zhǎng)至少約2倍、或3倍、或至少4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約7倍、或至少約8倍、或至少約9倍、或至少約10倍、或至少約12倍、或至少約15倍、或至少約17倍、或至少約20倍。

61、在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含fviii和一個(gè)或多個(gè)xten的重組因子viii融合蛋白，其中所述融合蛋白相較于未連接于xten的fviii展現(xiàn)在生理?xiàng)l件下的溶解度增加至少3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約7倍、或至少約8倍、或至少約9倍、或至少約10倍、或至少約15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。

62、在另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含本文所述的任何實(shí)施方案的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。

63、在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療受試者的凝血病變的方法，其包括向所述受試者施用包含凝結(jié)有效量的藥物組合物的組合物。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在所述施用之后，促凝血因子viii的血液濃度維持在約0.05、或1、或1.5iu/ml或更高持續(xù)至少所述施用之后48小時(shí)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種使受試者的血液凝結(jié)的方法，其包括使凝結(jié)有效量的藥物組合物與血液接觸。

64、在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種治療具有因子viii的循環(huán)抑制劑的受試者的凝血病變的方法，其包括向所述受試者施用包含治療有效量的cfxten的藥物組合物的組合物，其中所述組合物相較于包含未連接于xten且使用類似量施用的相應(yīng)因子viii的組合物展現(xiàn)在所述受試者中的促凝血活性更大。在所述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，凝血病變是甲型血友病。在另一實(shí)施方案中，凝血病變是創(chuàng)傷或手術(shù)或感染的結(jié)果。

65、本發(fā)明提供一種治療受試者的出血事件的方法，其包括向所述受試者施用包含凝結(jié)有效量的cfxten藥物組合物的組合物，其中所述凝結(jié)有效量的融合蛋白相較于未連接于xten且使用類似量向所述受試者施用的相應(yīng)因子viii遏止出血事件持續(xù)的時(shí)期長(zhǎng)至少3倍、或至少4倍、或至少5倍。未連接于xten的相應(yīng)因子viii的非限制性實(shí)例包括天然fviii、表1的序列、bdd-fviii和pcb0114?fviii。

66、在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于治療甲型血友病患者的醫(yī)藥方案的cfxten重組因子viii融合蛋白，所述方案包括包含cfxten融合蛋白的藥物組合物。在所述醫(yī)藥方案的一個(gè)實(shí)施方案中，方案進(jìn)一步包括確定為在甲型血友病患者中實(shí)現(xiàn)止血所需的包含cfxten的藥物組合物的量的步驟。在另一實(shí)施方案中，用于治療甲型血友病受試者的醫(yī)藥方案包括以有效量連續(xù)兩劑或更多劑向受試者施用藥物組合物，其中相較于未連接于xten且使用類似劑量施用的因子viii，所述施用導(dǎo)致至少一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)與甲型血友病相關(guān)的參數(shù)較大改善至少10％、或20％、或30％、或40％、或50％、或60％、或70％、或80％、或90％。改善的參數(shù)的非限制性實(shí)例包括促凝血fviii的血液濃度、活化的部分凝血酶原(aptt)測(cè)定時(shí)間減少、單級(jí)或兩級(jí)凝結(jié)測(cè)定時(shí)間減少、出血事件的發(fā)作延遲、顯色測(cè)定時(shí)間減少、出血測(cè)定時(shí)間減少、出血事件解決、或相對(duì)于天然fviii的畢提斯達(dá)效價(jià)降低。

67、在另一方面，本發(fā)明提供編碼cfxten融合蛋白的任一實(shí)施方案的融合蛋白的分離的核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸是編碼實(shí)施方案的cfxten融合蛋白的序列的互補(bǔ)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸進(jìn)一步包含編碼信號(hào)肽的序列，其中所述序列是

68、atgcaaatagagctctccacctgcttctttctgtgccttttgcgattctgctttagt(seq?id?no：1613)或其互補(bǔ)序列。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含編碼融合蛋白的核酸或其互補(bǔ)序列的表達(dá)載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含前述表達(dá)載體的分離的宿主細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生任何實(shí)施方案的融合蛋白的方法，其包括提供包含表達(dá)載體的宿主細(xì)胞；培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)所述融合蛋白的產(chǎn)生；以及回收所述融合蛋白。

69、在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的融合蛋白，其包含當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，相較于選自表21的具有類似長(zhǎng)度的序列具有至少約80％序列同一性、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％或約99％至約100％序列同一性的多肽。

70、在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的核酸，其包含選自以下的多核苷酸序列：(a)當(dāng)最優(yōu)比對(duì)時(shí)，相較于選自表21的具有類似長(zhǎng)度的序列具有至少約80％序列同一性、或約90％、或約91％、或約92％、或約93％、或約94％、或約95％、或約96％、或約97％、或約98％或約99％至約100％序列同一性的序列，或(b)(a)的多核苷酸的互補(bǔ)序列。在另一實(shí)施方案中，分離的核酸包含連接于(a)的核酸的5’末端的序列atgcaaatagagctctccacctgcttctttctgtgccttttgcgattctgctttagt(seq?id?no：1613)或所述序列的連接于(b)的3’末端的互補(bǔ)序列。

71、明確涵蓋的是重組因子viii融合蛋白可展現(xiàn)本文公開(kāi)的性質(zhì)的一者或多者或任何組合。

72、以引用的方式并入

73、本說(shuō)明書(shū)中提及的所有公布、專利和專利申請(qǐng)都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就如同已特定地和個(gè)別地指示將各個(gè)別公布、專利或?qū)＠暾?qǐng)以引用的方式并入一般。