發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及共刺激或共抑制信號(hào)傳導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)(包括ctla-4)的抗體。更特別地，本發(fā)明進(jìn)一步涉及針對(duì)犬ctla-4的犬源化抗體(caninized?antibodies)，其具有特異性序列和對(duì)犬ctla-4的高結(jié)合親和力。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的抗體在治療犬科動(dòng)物的癌癥中的用途。

背景技術(shù)：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、免疫應(yīng)答的起始或終止經(jīng)由信號(hào)傳導(dǎo)途徑介導(dǎo)，所述信號(hào)傳導(dǎo)途徑由在許多免疫細(xì)胞(最值得注意的是t淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(apc))的表面上表達(dá)的一組蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜相互作用活化。共刺激信號(hào)傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致免疫應(yīng)答的發(fā)展，并且已經(jīng)顯示最重要的是通過(guò)t細(xì)胞表面上的cd28與apc表面上的b7.1(也稱為cd80)和b7.2(也稱為cd86)家族成員的相互作用介導(dǎo)的。b7.1和b7.2被認(rèn)為執(zhí)行類(lèi)似的功能。

2、相反，共抑制途徑導(dǎo)致免疫應(yīng)答的抑制或終止，并且已經(jīng)顯示是通過(guò)t細(xì)胞上的細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(ctla-4)和apc上的cd80/cd86蛋白之間的相互作用介導(dǎo)的。已經(jīng)顯示另外的共抑制信號(hào)傳導(dǎo)途徑是通過(guò)t細(xì)胞上的程序性細(xì)胞死亡受體1(pd-1)和apc上的程序性細(xì)胞死亡受體配體1或2(pd-l1/pd-l2)蛋白之間的相互作用介導(dǎo)的。此外，還已經(jīng)顯示pd-l1和cd80之間的相互作用也可以在t細(xì)胞中產(chǎn)生抑制信號(hào)。

3、cd80和cd86是免疫球蛋白(ig)超家族的成員[sharpe和freeman，naturereviews，2:116-126(2002)]。cd80在活化的b細(xì)胞、活化的t細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞上表達(dá)[swanson?and?hall,eur?j.immunol.,23:295-298(1993)；razi-wolfe?et?al.,pnas,89:4210-4214(1992)]。cd86在樹(shù)突狀細(xì)胞、朗格漢斯細(xì)胞和b細(xì)胞上組成型表達(dá)。此外，cd?86在單核細(xì)胞上表達(dá)，并且在ifn-γ刺激之后上調(diào)[larsen?et?al.,immunol.,152:5208-5219(1994)；inaba,j.exp.med.180:1849-1860(1994)]。

4、cd80和cd86結(jié)合cd?28和ctla-4，具有不同的功能結(jié)果[linsley?et?al.,pnas,87:5031-5035(1990)；linsley?et?al.,j.exp.med.,173:721-730(1991)；azuma?et?al.,nature?366:76-79(1993)；freeman?et?al.,science?262:909-912(1993)]。cd?80和cd?86與ctla-4的結(jié)合比cd80/cd?86與cd?28的結(jié)合具有高得多的親和力[van?der?merwe,j.exp.med.185:393-402(1997)]。

5、cd28是同源二聚體糖蛋白，其是ig超家族的成員[aruffo?and?seed,pnas,84:8573-8577(1987)]。成熟蛋白質(zhì)具有134個(gè)氨基酸殘基的單個(gè)細(xì)胞外可變結(jié)構(gòu)域，其包含對(duì)反受體(counter?receptor)結(jié)合必不可少的六肽基序mypppy[riley?and?june,blood,105:13–21(2005)]。cd28的41個(gè)氨基酸的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有四個(gè)酪氨酸殘基，其在活化時(shí)可以被磷酸化[sharpe?and?freeman,nat.rev.immunol.,2:116–126(2002)]。cd28在大多數(shù)cd4+t細(xì)胞和約50％的cd8+t細(xì)胞上表達(dá)[gross?et?al.,j.immunol.,149:380-388(1992)；riley?and?june,blood,105:13–21(2005)]。在t細(xì)胞受體(tcr)連接之后，b7.1/b7.2與cd28的結(jié)合為t細(xì)胞提供了關(guān)鍵的共刺激信號(hào)，從而允許t細(xì)胞活化和隨后的免疫應(yīng)答發(fā)展[reiser?et?al.,pnas,89:271-275(1992)；jenkins?et?al.,j.immunol.,147:2461-2466(1991)]。已經(jīng)表明，在不存在cd?28信號(hào)的情況下，t細(xì)胞經(jīng)歷細(xì)胞凋亡或進(jìn)入無(wú)應(yīng)答狀態(tài)[jenkins?et?al.,j.exp.med.165:302-319(1987)；jenkins?et?al.,pnas,84:5409-5413(1987)；schwartz,science,248:1349-1356(1990)]。cd28-b7.1/b7.2結(jié)合可以改變活化所需的tcr連接的閾值水平(例如，抗原-mhc復(fù)合物的量)，減少刺激初始細(xì)胞所需的時(shí)間并增強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答的幅度[soskic?et?al.,advances?in?immunology,124:96-123(2014)]。

6、ctla-4(cd152)也是ig超家族的成員，并且由單個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)尾組成[swanson,immunology；1010:169-177(2000)]。另外，ctla-4與cd28共享約30％的氨基酸同一性。ctla-4不在初始t細(xì)胞上組成型表達(dá)，盡管其在cd28連接和t細(xì)胞活化之后不久快速上調(diào)，其中ctla-4的峰值表達(dá)水平在初始t細(xì)胞活化之后約48-96小時(shí)[alegreet?al.,j.immunol.,157:4762-4770(1996)；freeman?et?al.,j.immunol.,149:3795-3801(1992)]。ctla-4以比cd28高得多的親和力結(jié)合b7.1和b7.2兩者[van?der?merwe等人，j.exp.med.，185:393-402(1997)]。然而，與cd28結(jié)合b7.1或b7.2的刺激作用相反，ctla-4作為抑制性受體起作用，其對(duì)于免疫應(yīng)答的下調(diào)是至關(guān)重要的[walnus?et?al.,immunity,1:405-413(1994)；walnus,j.exp.med.,183:2541-2550(1996)；krummel和allison,j.exp.med.,183:2533-2540(1996)]。ctla-4介導(dǎo)其免疫抑制功能的機(jī)制與其充當(dāng)cd28與cd80/cd86之間相互作用的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的能力有關(guān)[綜述在swanson,immunology,1010:169-177(2000)]中。ctla-4在免疫下調(diào)中的關(guān)鍵作用在ctla-4缺陷的小鼠中得到證實(shí)，所述小鼠在3-5周齡時(shí)因?yàn)榘l(fā)展了以多個(gè)器官的t細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的淋巴增殖性疾病而死亡[tivol?et?al.,immunity,3:541-5417(1995)；waterhouse?et?al.,science,270:985-988(1995)]。還證實(shí)ctla-4敲除的后果取決于cd28與其配體cd80和cd86的相互作用，如在ctla-4/cd80/cd86三重敲除小鼠中沒(méi)有疾病所示[mandelbrot?et?al.,j.exp.med.,189:435-440(1999)]。這也通過(guò)在ctla-4敲除小鼠中重復(fù)施用ctla-4ig得到的抗淋巴增殖的保護(hù)得到證實(shí)[tivol?et?al.,j?immunol.,158:5091-5094(1997)]。

7、另外，已經(jīng)顯示用抗體阻斷ctla-4的作用增強(qiáng)體外和體內(nèi)的t細(xì)胞應(yīng)答，并增加抗腫瘤免疫應(yīng)答[leach?et?al.,science,271:1734-1736(1996)]。基于這些發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行ctla-4阻斷劑如單克隆抗體的開(kāi)發(fā)以提供用于治療癌癥的治療模態(tài)[hodi?et?al.,pnas,100(8):4712-4717(2003)；phan?gq?et?al.,pnas,100(14):8372-8377(2003)；attia,journalof?clinical?oncology,23(25):6043-6053(2005)；comin-anduix?et?al.,journal?oftranslational?medicine,6:22-22(2008)；wo2000037504?a2；u.s.8,017,114b2；wo2010097597a1；wo2012120125a1；和boutros?et?al.,nat?rev?clin?oncol.,13(8):473-486(2016)]。

8、pd-1是cd28/ctla-4免疫調(diào)節(jié)受體家族的成員。pd-1也是ig超家族的成員，并且包含結(jié)合其配體的細(xì)胞外可變結(jié)構(gòu)域和結(jié)合信號(hào)傳導(dǎo)分子的胞質(zhì)尾[綜述在zak?et?al.,cell?structure,25:1163-1174(2017)]。pd-1的胞質(zhì)尾包含兩個(gè)酪氨酸基的信號(hào)傳導(dǎo)基序[zhang?et?al.,immunity?20:337–347(2004)]。在未刺激的t細(xì)胞、b細(xì)胞或骨髓細(xì)胞上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)pd-1表達(dá)。然而，在活化之后，pd-1表達(dá)在這些細(xì)胞上上調(diào)[chemnitz?et?al.,j.immunol.,173:945–954(2004)；petrvas?et?al.,j.exp.med.,203:2281-2292(2006)]。pd-1與ctla-4最密切相關(guān)，共享約24％的氨基酸同一性[jin?et?al.,current?topics?inmicrobiology?and?immunology,350:17-37(2010)]。當(dāng)與在apc表面上表達(dá)的pd-l1和pd-l2結(jié)合時(shí)，pd-1減弱t細(xì)胞活化。這些配體中的任一種與pd-1的結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)經(jīng)由t細(xì)胞受體(tcr)的抗原信號(hào)傳導(dǎo)。迄今為止，僅發(fā)現(xiàn)pd-l1和pd-l2充當(dāng)pd-1的配體。與ctla-4一樣，pd-1結(jié)合似乎傳遞負(fù)免疫調(diào)節(jié)信號(hào)。通過(guò)pd-l1或pd-l2連接pd-1導(dǎo)致對(duì)tcr介導(dǎo)的增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制[jin?et?al.,current?topics?in?microbiology?and?immunology,350:17-37(2010)]。與ctla-4缺陷的動(dòng)物相反，pd-1缺陷的小鼠在生命中死亡遲得多，并顯示自身免疫的跡象，盡管觀察到的影響的嚴(yán)重程度不如ctla-4缺陷的動(dòng)物顯示出的那些嚴(yán)重[nishimura?et?al.,immunity,11(2):141–151(1999)；nishimura?et?al.,science,291(5502):319–322(2001)]。盡管pd-1信號(hào)傳導(dǎo)途徑目前正在進(jìn)行深入研究，但是迄今為止的研究表明pd-l1/pd-l2/pd-1相互作用參與一些免疫應(yīng)答的負(fù)調(diào)節(jié)，因?yàn)閠cr刺激下游的信號(hào)減少導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌減少和t細(xì)胞增殖受損以及t細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性分子的減少[freeman?et?al.,j.exp.med.,192(7):1027–1034(2000)]。

9、pd-l1(cd274)是1型膜蛋白，由igv樣和igc樣細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域和短胞質(zhì)尾(由30個(gè)氨基酸組成)組成，具有未知的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)。pd-l1被認(rèn)為是b7家族的成員，并且與b7家族成員共享約20％的氨基酸同一性。pdl1結(jié)合在活化的t細(xì)胞、b細(xì)胞和骨髓細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的其受體pd-1。pd-l1還結(jié)合共刺激分子cd80，但不結(jié)合cd86[butte?et?al.,immunology,45(13):3567–3572(2008)]。cd80對(duì)于pd-l1的親和力介于其對(duì)cd28和ctla-4的親和力之間。相關(guān)分子pd-l2對(duì)于cd80或cd86沒(méi)有親和力，但共享作為受體的pd-1。pd-l1與t細(xì)胞上的其受體pd-1的接合遞送抑制tcr介導(dǎo)的il-2產(chǎn)生和t細(xì)胞增殖的信號(hào)。pd-l1與pd-1的結(jié)合還有助于在向初始t細(xì)胞呈遞抗原期間配體誘導(dǎo)的tcr下調(diào)。另外，pd-l1與t細(xì)胞上的cd80結(jié)合導(dǎo)致t細(xì)胞凋亡。pd1和pd-l1作為t細(xì)胞活化抑制劑的作用已經(jīng)在許多研究中得到證實(shí)?；谶@些發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行pd-1和pd-l1阻斷劑如單克隆抗體的開(kāi)發(fā)，以提供用于治療癌癥和感染性疾病的治療模式。

10、已經(jīng)開(kāi)發(fā)了阻斷犬pd-1、pdl1和ctla-4的結(jié)合和活性的人源化單克隆抗體，并且目前可用于治療被診斷患有幾種不同類(lèi)型的癌癥之一的人類(lèi)受試者。類(lèi)似地，還報(bào)道了阻斷犬pd-1和pd?l1的結(jié)合和活性的犬源化單克隆抗體[u.s.9,944,704b2、u.s.10,106,607b2和u.s.2018/0237535a1，將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文]。然而，迄今為止還沒(méi)有阻斷犬ctla-4的結(jié)合和活性的犬源化單克隆抗體的任何報(bào)道。

11、本文對(duì)任何參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)當(dāng)被解釋為承認(rèn)這樣的參考文獻(xiàn)可作為本技術(shù)的“現(xiàn)有技術(shù)”獲得。

12、發(fā)明簡(jiǎn)述

13、本發(fā)明涉及結(jié)合犬ctla-4的抗犬細(xì)胞毒性t-淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(ctla-4)抗體。在特定的實(shí)施方案中，犬ctla-4的抗體特異性結(jié)合犬ctla-4。在更特定的實(shí)施方案中，犬ctla-4的抗體還具有阻斷犬ctla-4與犬cd80結(jié)合的能力。在其它特定實(shí)施方案中，犬ctla-4的抗體還具有阻斷犬ctla-4與犬cd86結(jié)合的能力。在仍然其他特定的實(shí)施方案中，犬ctla-4的抗體還同時(shí)具有阻斷犬ctla-4與犬cd80結(jié)合和阻斷犬ctla-4與犬cd86結(jié)合的能力。

14、此外，本發(fā)明涉及由這些抗體所包含的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)和這些cdr(例如，從鼠抗犬ctla-4抗體獲得)的組合在犬框架中以形成犬源化抗犬ctla-4抗體。本發(fā)明還涉及這樣的抗體在治療例如癌癥的病癥中的用途。

15、因此，本發(fā)明提供來(lái)自六(6)個(gè)示例性的鼠抗犬ctla-4抗體的獨(dú)特的cdr組。六種示例性的鼠抗犬ctla-4抗體具有獨(dú)特的cdr組，即三個(gè)輕鏈cdr：cdr輕鏈1(cdrl1)、cdr輕鏈2(cdrl2)和cdr輕鏈3(cdrl3)和三個(gè)重鏈cdr：cdr重鏈1(cdrh1)、cdr重鏈2(cdrh2)和cdr重鏈3(cdrh3)。如下詳述的，在每組cdr內(nèi)存在實(shí)質(zhì)性序列同源性，并且甚至存在一些冗余度(例如，參見(jiàn)下表1中的vl?cdr-3'組)。因此，本發(fā)明不僅提供來(lái)自六種示例性的鼠抗犬ctla-4抗體的六個(gè)cdr的氨基酸序列，而且還提供這些cdr的保守修飾的變體，以及與犬ctla-4的表位所包含的犬ctla-4包含(例如，共享)相同的規(guī)范結(jié)構(gòu)(canonicalstructure)和/或與其一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3、4或更多個(gè))氨基酸殘基結(jié)合的變體。

16、本發(fā)明的一個(gè)方面提供結(jié)合犬細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(ctla-4)的哺乳動(dòng)物抗體。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段是鼠抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物抗體(包括本發(fā)明的鼠抗體)或其抗原結(jié)合片段是犬源化抗體或其犬源化抗原結(jié)合片段。

17、在特定的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物抗體特異性結(jié)合犬ctla-4。在更特定的實(shí)施方案中，犬ctla-4的哺乳動(dòng)物抗體還具有阻斷犬ctla-4與犬cd80結(jié)合的能力。在其他特定的實(shí)施方案中，犬ctla-4的哺乳動(dòng)物抗體還具有阻斷犬ctla-4與犬cd86結(jié)合的能力。在仍然其它特定實(shí)施方案中，犬ctla-4的哺乳動(dòng)物抗體具有阻斷犬ctla-4與犬cd?80結(jié)合和阻斷犬ctla-4與犬cd?86結(jié)合兩者的能力。

18、在某些實(shí)施方案中，結(jié)合犬ctla-4的哺乳動(dòng)物抗體是分離的抗體。本發(fā)明還提供結(jié)合犬ctla-4的任何這些哺乳動(dòng)物抗體的抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施方案中，抗體包含三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)：cdr輕鏈1(cdrl1)、cdr輕鏈2(cdrl2)和cdr輕鏈3(cdrl3)；和三個(gè)重鏈cdr：cdr重鏈1(cdrh1)、cdr重鏈2(cdrh2)和cdr重鏈3(cdrh3)。

19、在特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段包含cdrh3，其包含seq?id?no:90的氨基酸序列、seq?id?no:90的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別7的seq?id?no:90的變體。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含cdrh2，其包含seq?id?no:88的氨基酸序列、seq?id?no:88的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別2a的seq?id?no:88的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含：包含seq?id?no:86的氨基酸序列的cdrh1，包含seq?id?no:86的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seqid?no:86的變體的cdrh1。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrh3，其包含seq?id?no:96的氨基酸序列、seq?id?no:96的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:96的變體。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含cdrh2，其包含seq?id?no:94的氨基酸序列、seq?id?no:94的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:94的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl1，其包含seq?id?no:92的氨基酸序列，seq?id?no:92的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別4的seq?id?no:92的變體。

20、在可替代的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段包含cdrh3，其包含seq?id?no:102的氨基酸序列，seq?id?no:102的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別9的seq?id?no:102的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含cdrh2，其包含seq?id?no:100的氨基酸序列，seq?id?no:100的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別4的seq?id?no:100的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含：包含seq?id?no:98的氨基酸序列的cdrh1，包含seq?id?no:98的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:98的變體的cdrh1。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl3，其包含seq?id?no:108的氨基酸序列、seq?id?no:108的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:108的變體。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl2，其包含seq?id?no:106的氨基酸序列、seq?id?no:106的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:106的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl1，其包含seq?id?no:104的氨基酸序列，seq?id?no:104的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:104的變體。

21、在其它可替代的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段包含cdrh3，其包含seq?id?no:113的氨基酸序列，seq?id?no:113的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別7的seq?id?no:113的變體。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含cdrh2，其包含seq?id?no:88的氨基酸序列，seq?id?no:88的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別2a的seq?id?no:88的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含：包含seq?id?no:86的氨基酸序列的cdrh1，包含seq?id?no:86的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:86的變體的cdrh1。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl3，其包含seq?id?no:96的氨基酸序列，seq?id?no:96的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:96的變體。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl2，其包含seq?idno:94的氨基酸序列，seq?id?no:94的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:94的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl1，其包含seq?id?no:117的氨基酸序列，seq?id?no:117的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別4的seq?id?no:117的變體。

22、在仍然其它可替代的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段包含cdrh3，其包含seq?id?no:115的氨基酸序列，seq?id?no:115的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別7的seq?id?no:115的變體。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含cdrh2，其包含seq?id?no:88的氨基酸序列，seq?id?no:88的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別2a的seq?id?no:88的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含：包含seq?idno:86的氨基酸序列的cdrh1，包含seq?id?no:86的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:86的變體的cdrh1。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl3，其包含seq?id?no:96的氨基酸序列，seq?idno:96的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:96的變體。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl2，其包含seq?id?no:122的氨基酸序列，seq?id?no:122的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:122的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl1，其包含seq?id?no:119的氨基酸序列，seq?id?no:119的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別4類(lèi)的seq?id?no:119的變體。

23、在仍然其它可替代的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段包含cdrh3，其包含seq?id?no:114的氨基酸序列，seq?id?no:114的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別7的seq?id?no:114的變體。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含cdrh2，其包含seq?id?no:111的氨基酸序列，seq?idno:111的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別2a的seq?id?no:111的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含：包含seq?idno:109的氨基酸序列的cdrh1，包含seq?id?no:109的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:109的變體的cdrh1。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl3，其包含seq?id?no:96的氨基酸序列，seq?idno:96的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:96的變體。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl2，其包含seq?id?no:121的氨基酸序列，seq?id?no:121的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:121的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl1，其包含seq?id?no:118的氨基酸序列，seq?id?no:118的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別4類(lèi)的seq?id?no:118的變體。

24、在仍然其它可替代的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段包含cdrh3，其包含seq?id?no:116的氨基酸序列，seq?id?no:116的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別12的seq?id?no:116的變體。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含cdrh2，其包含seq?id?no:112的氨基酸序列，seq?idno:112的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別2a的seq?id?no:112的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含：包含seq?idno:110的氨基酸序列的cdrh1，包含seq?id?no:110的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:110的變體的cdrh1。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl3，其包含seq?id?no:124的氨基酸序列，seqid?no:124的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:124的變體。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl2，其包含seq?id?no:123的氨基酸序列，seq?id?no:123的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別1的seq?id?no:123的變體。在甚至更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段還進(jìn)一步包含cdrl1，其包含seq?id?no:120的氨基酸序列，seqid?no:120的氨基酸序列的保守修飾的變體或包含規(guī)范結(jié)構(gòu)類(lèi)別2的seq?id?no:120的變體。

25、如上所述，針對(duì)犬ctla-4的犬源化抗體或其犬源化抗原結(jié)合片段是本發(fā)明的一個(gè)重要方面，并且本發(fā)明提供所有這樣的哺乳動(dòng)物抗體的犬源化哺乳動(dòng)物抗體，包括犬源化鼠抗體。因此，本發(fā)明還提供特異性結(jié)合ctla-4的分離的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含犬igg重鏈和犬κ或λ輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述犬κ或λ輕鏈包含三個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)：cdr輕鏈1(cdrl1)、cdr輕鏈2(cdrl2)和cdr輕鏈3(cdrl3)；并且所述犬igg重鏈包含三個(gè)重鏈cdr：cdr重鏈1(cdrh1)、cdr重鏈2(cdrh2)和cdr重鏈3(cdrh3)，其獲自鼠抗犬ctla-4抗體。本發(fā)明的犬源化抗體及其抗原結(jié)合片段的特定實(shí)施方案結(jié)合犬ctla-4和/或阻斷犬ctla-4與犬cd80和/或犬cd86的結(jié)合。

26、本發(fā)明的犬源化抗體或其犬源化抗原結(jié)合片段可包含含有鉸鏈區(qū)的iggd，所述鉸鏈區(qū)包含seq?id?no:128的氨基酸序列。在一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)包含seq?id?no:129的氨基酸序列。在仍然另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)包含seq?id?no:130的氨基酸序列。在仍然另一個(gè)相關(guān)的實(shí)施方案中，鉸鏈區(qū)包含seq?id?no：131的氨基酸序列。

27、在可替代的實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:62的氨基酸序列的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述重鏈由seq?id?no:61的核苷酸序列編碼。在其它實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:64的氨基酸序列的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述重鏈由seq?id?no:63的核苷酸序列編碼。在仍然其它實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:66的氨基酸序列的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，重鏈由seqid?no:65的核苷酸序列編碼。在更特定的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seqid?no:50的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:49的核苷酸序列編碼。在其它特定實(shí)施方案中，所述犬源化抗體還包含含有seq?id?no:52的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:51的核苷酸序列編碼。在仍然其它特定實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?id?no:54的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:53的核苷酸序列編碼。

28、在可替代的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:74的氨基酸序列的修飾的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述修飾的重鏈由seq?id?no:73的核苷酸序列編碼。在其它實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:76的氨基酸序列的修飾的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述修飾的重鏈由seq?id?no:75的核苷酸序列編碼。在仍然其它的實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:78的氨基酸序列的修飾的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述修飾的重鏈由seq?id?no:77的核苷酸序列編碼。在更特定的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?id?no:50的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:49的核苷酸序列編碼。在其它的特定的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?id?no:52的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:51的核苷酸序列編碼。在仍然其它特定實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?id?no:54的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:53的核苷酸序列編碼。

29、在特定的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:66的氨基酸序列的重鏈和含有seq?id?no:52的氨基酸序列的輕鏈。在其它實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:66的氨基酸序列的重鏈和含有seq?id?no:54的氨基酸序列的輕鏈。

30、在可替代的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:78的氨基酸序列的修飾的重鏈和含有seq?id?no:52的氨基酸序列的輕鏈。在其它實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:78的氨基酸序列的修飾的重鏈和含有seq?id?no:54的氨基酸序列的輕鏈。

31、在其它實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:68的氨基酸序列的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述重鏈由seq?id?no:67的核苷酸序列編碼。在其它實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:70的氨基酸序列的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述重鏈由seq?id?no:69的核苷酸序列編碼。在仍然其它的實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:72的氨基酸序列的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述重鏈由seq?id?no:71的核苷酸序列編碼。在更特定的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?id?no:56的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?idno:55的核苷酸序列編碼。在其它特定實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?idno:58的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:57的核苷酸序列編碼。在仍然其它的特定實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?idno:60的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:59的核苷酸序列編碼。

32、在可替代的實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:80的氨基酸序列的修飾的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述修飾的重鏈由seq?id?no:79的核苷酸序列編碼。在其它實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:82的氨基酸序列的修飾的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述修飾的重鏈由seq?id?no:81的核苷酸序列編碼。在仍然其它的實(shí)施方案中，犬源化抗體包含含有seq?id?no:84的氨基酸序列的修飾的重鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述修飾的重鏈由seq?id?no:83的核苷酸序列編碼。在更特定的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?id?no:56的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:55的核苷酸序列編碼。在其它特定實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?id?no:58的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:57的核苷酸序列編碼。在仍然其它特定實(shí)施方案中，所述犬源化抗體進(jìn)一步包含含有seq?id?no:60的氨基酸序列的輕鏈。在這種類(lèi)型的特定實(shí)施方案中，所述輕鏈由seq?id?no:59的核苷酸序列編碼。

33、在特定的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:72的氨基酸序列的修飾的重鏈和含有seq?id?no:58的氨基酸序列的輕鏈。在其它實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:72的氨基酸序列的重鏈和含有seq?id?no:60的氨基酸序列的輕鏈。

34、在可替代的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:84的氨基酸序列的修飾的重鏈和含有seq?id?no:58的氨基酸序列的輕鏈。在其它實(shí)施方案中，所述犬源化抗體包含含有seq?id?no:84的氨基酸序列的修飾的重鏈和含有seq?id?no:60的氨基酸序列的輕鏈。

35、本發(fā)明進(jìn)一步提供以低于1×10-12m(例如，5x?10-13m或更低)的解離常數(shù)(kd)結(jié)合犬ctla-4的哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×10-5m至1×10-12m的解離常數(shù)結(jié)合犬ctla-4。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×10-7m至1×10-11m的解離常數(shù)結(jié)合犬ctla-4。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×10-8m至1×10-11m的解離常數(shù)結(jié)合犬ctla-4。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×10-8m至1×10-10m的解離常數(shù)結(jié)合犬ctla-4。

36、本發(fā)明還提供以大于1×107m-1s-1的結(jié)合速率(on?rate)(kon)結(jié)合犬ctla-4的哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×102m-1s-1至1×107m-1s-1的結(jié)合速率結(jié)合犬ctla-4。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×103m-1s-1至1×106m-1s-1的結(jié)合速率結(jié)合犬ctla-4。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×103m-1s-1至1×105m-1s-1的結(jié)合速率結(jié)合犬ctla-4。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×104m-1s-1至1×105m-1s-1的速率結(jié)合犬ctla-4。

37、本發(fā)明進(jìn)一步提供以低于1×10-7s-1的解離速率(off?rate)(koff)結(jié)合犬ctla-4的哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×10-3s-1至1×10-8s-1的解離速率結(jié)合犬ctla-4。在更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×10-4s-1至1×10-7s-1的解離速率結(jié)合犬ctla-4。在仍然更特定的實(shí)施方案中，所述哺乳動(dòng)物抗體或其抗原結(jié)合片段以1×10-5s-1至1×10-7s-1的解離速率結(jié)合犬ctla-4。

38、在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物抗體(包括嵌合抗體)阻斷犬cd80和/或cd86與犬ctla-4的結(jié)合。在更特定的實(shí)施方案中，所述抗體以1×10-8m至1×10-9m或甚至更低濃度的最小ec50阻斷犬cd80和/或cd86與犬ctla-4的結(jié)合。在仍然更特定的實(shí)施方案中，ec50為5×10-9m至5×10-13m。因此，在仍然更特定的實(shí)施方案中，ec50在5×10-9m至5×10-11m之間。因此，在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以顯示出一種、兩種、三種、四種或所有這些性質(zhì)，即上述與犬ctla-4的解離常數(shù)、上述與犬ctla-4結(jié)合的結(jié)合速率、上述從抗體-犬ctla-4結(jié)合復(fù)合物解離的解離速率，或有效治療動(dòng)物受試者中的癌癥。

39、本發(fā)明進(jìn)一步提供與本文公開(kāi)的哺乳動(dòng)物抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)的犬源化哺乳動(dòng)物抗體和抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施方案中，所述犬源化哺乳動(dòng)物抗體與包含45a9的6個(gè)cdr的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)[參見(jiàn)下表1]。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述犬源化哺乳動(dòng)物抗體與包含27g12的6個(gè)cdr的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)[參見(jiàn)下表1]。在仍然其它相關(guān)的實(shí)施方案中，所述犬源化哺乳動(dòng)物抗體與包含22a11的6個(gè)cdr的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)[參見(jiàn)下表1]。在仍然相關(guān)的實(shí)施方案中，所述犬源化哺乳動(dòng)物抗體與包含110e3的6個(gè)cdr的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)[參見(jiàn)下表1]。在特定的實(shí)施方案中，所述犬源化哺乳動(dòng)物抗體與包含12b3的6個(gè)cdr的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)[參見(jiàn)下表1和3]。在其它特定實(shí)施方案中，所述犬源化哺乳動(dòng)物抗體與包含39a11的6個(gè)cdr的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)[參見(jiàn)下表1和3]。在特定的實(shí)施方案中，測(cè)定是標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，用進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定。在另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定用elisa進(jìn)行。在仍然另一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。

40、如上所述，本發(fā)明的抗體(和其抗原結(jié)合片段)，包括前述抗體(和其抗原結(jié)合片段)，可以是單克隆抗體(和其抗原結(jié)合片段)，哺乳動(dòng)物抗體(和其抗原結(jié)合片段)例如鼠(小鼠)抗體(和其抗原結(jié)合片段)，犬源化抗體(和其抗原結(jié)合片段)，包括犬源化鼠抗體(和其抗原結(jié)合片段)。在某些實(shí)施方案中，抗體(和其抗原結(jié)合片段)是分離的。

41、在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的犬源化抗體或其抗原性片段結(jié)合犬ctla-4的氨基酸序列的表位。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體與seq?id?no:138的氨基酸序列的位置t35、r38、t51、t53、y90、k93、y98和y102處的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述犬源化抗體與seq?id?no:138的氨基酸序列的位置35t、r38、s42、k93和y102處的氨基酸殘基中的一個(gè)或多個(gè)相互作用。

42、本發(fā)明進(jìn)一步提供結(jié)合seq?id?no:132、seq?id?no:133、seq?id?no:134、seq?idno:135、seq?id?no:136和seq?id?no:137的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)表位或其部分的犬源化抗體。在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的犬源化抗體或其抗原片段結(jié)合由seq?id?no:132的氨基酸序列所包含的表位或其部分。在這種類(lèi)型的一個(gè)更特定的實(shí)施方案中，所述表位或其部分由seq?id?no:134的氨基酸序列所包含。在這種類(lèi)型的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表位或其部分由seq?id?no:135的氨基酸序列所包含。在某些實(shí)施方案中，所述表位或其部分由seq?id?no:133的氨基酸序列所包含。在這種類(lèi)型的一個(gè)更特定的實(shí)施方案中，所述表位或其部分由seq?id?no:136的氨基酸序列所包含。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述犬源化抗體結(jié)合由seq?id?no:134和/或seq?id?no:136和/或seq?id?no:135的氨基酸序列所包含的一個(gè)或多個(gè)表位或其部分。

43、本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的犬源化抗體的任一個(gè)輕鏈的核酸(包括分離的和/或重組的核酸)。類(lèi)似地，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的犬源化抗體的任一個(gè)重鏈的分離的核酸(包括分離的和/或重組的核酸)。

44、本發(fā)明進(jìn)一步提供包含一種或多種本發(fā)明的核酸(包括分離的核酸)的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供包含一種或多種本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

45、在特定的實(shí)施方案中，抗體是重組抗體或其抗原結(jié)合片段。在相關(guān)的實(shí)施方案中，可變重鏈結(jié)構(gòu)域和可變輕鏈結(jié)構(gòu)域通過(guò)柔性接頭連接以形成單鏈抗體。在特定的實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是fab片段。在其它實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是fab'片段。在仍然其它實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是(fab')2片段。在仍然其它實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是雙抗體。在特定的實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是結(jié)構(gòu)域抗體。在特定的實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是單結(jié)構(gòu)域抗體。

46、在特定的實(shí)施方案中，犬源化鼠抗犬ctla-4抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合正在治療癌癥的動(dòng)物受試者(例如，犬)中的ctla-4。在更特定的實(shí)施方案中，施用本發(fā)明的犬源化鼠抗犬ctla-4抗體或抗原結(jié)合片段用于改善正在治療的動(dòng)物受試者(例如，犬科動(dòng)物)中癌癥的一種或多種癥狀。

47、本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼犬源化鼠抗犬ctla-4抗體或其部分的分離的核酸。在相關(guān)的實(shí)施方案中，這樣的抗體或抗原結(jié)合片段可用于制備治療犬科動(dòng)物受試者中的癌癥的藥物。可替代地或聯(lián)合地，本發(fā)明提供本發(fā)明的任何抗體或抗體片段用于診斷用途的用途。在另外的實(shí)施方案中，提供包含本文公開(kāi)的任何犬源化抗體或抗原結(jié)合片段的試劑盒。

48、本發(fā)明進(jìn)一步提供結(jié)合本發(fā)明的犬源化抗體的分離的肽，其包含5至25個(gè)氨基酸殘基，且與seq?id?no:132的氨基酸序列90％相同或更高。在特定的實(shí)施方案中，所述分離的肽與seq?id?no:132的氨基酸序列相同。在更特定的實(shí)施方案中，所述分離的肽包含10至20個(gè)氨基酸殘基。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述分離的肽結(jié)合本發(fā)明的犬源化抗體，包含5至25個(gè)氨基酸殘基，且與seq?id?no:133的氨基酸序列90％相同或更高。在特定的實(shí)施方案中，所述分離的肽與seq?id?no:133的氨基酸序列相同。在這種類(lèi)型的更特定的實(shí)施方案中，所述分離的肽包含10至20個(gè)氨基酸殘基。

49、在仍然其它實(shí)施方案中，結(jié)合本發(fā)明的犬源化抗體的分離的肽包含與seq?id?no:134的氨基酸序列90％相同或更高的氨基酸序列。在仍然其它實(shí)施方案中，所述分離的肽包含與seq?id?no:134的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，與本發(fā)明的犬源化抗體結(jié)合的分離的肽包含與seq?id?no:135的氨基酸序列90％相同或更高的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，所述分離的肽包含與seq?id?no:135的氨基酸序列相同的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，結(jié)合本發(fā)明的犬源化抗體的分離的肽包含與seq?id?no:136的氨基酸序列90％相同或更高的氨基酸序列。在仍然其它實(shí)施方案中，所述分離的肽包含與seqid?no:136的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

50、本發(fā)明進(jìn)一步提供融合蛋白，其包含結(jié)合本發(fā)明的犬源化抗體的這樣的分離的肽。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含任一種上述肽的融合蛋白。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含這樣的抗原肽和非犬哺乳動(dòng)物igg抗體的fc區(qū)。在一個(gè)更特定的實(shí)施方案中，融合蛋白包含非犬哺乳動(dòng)物igg抗體的fc區(qū)。在某些實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是鼠igg。在可替代的實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是人igg。在其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是馬igg。在仍然其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是豬igg。在仍然其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是牛igg。

51、在特定的實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是igg1。在其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是igg2a。在仍然其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是igg3。在仍然其它實(shí)施方案中，所述非犬哺乳動(dòng)物igg抗體是igg4。在其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何上述抗原肽和麥芽糖結(jié)合蛋白。在仍然其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何上述抗原肽和β-半乳糖苷酶。在仍然其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶。在仍然其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和硫氧還蛋白。在仍然其他實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和gro?el。在仍然其它實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含任何前述抗原肽和nusa。

52、本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的一種或多種分離的免疫原性和/或抗原性肽和/或融合蛋白的核酸(包括分離的和/或重組的核酸)。本發(fā)明進(jìn)一步提供包含這樣的分離的核酸的表達(dá)載體，以及包含一種或多種本發(fā)明的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。

53、藥物組合物也可以包含來(lái)自犬ctla-4的抗原肽(包括分離的抗原肽)、包含本發(fā)明的來(lái)自犬ctla-4的抗原肽的融合蛋白、編碼本發(fā)明的抗原片段和/或融合蛋白的核酸(包括分離的核酸)、包含這樣的核酸的表達(dá)載體或其任何組合，以及可藥用載體或稀釋劑。此外，本發(fā)明包括包含本發(fā)明的抗犬ctla-4抗體(包括犬源化鼠抗犬ctla-4抗體)或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物。這樣的藥物組合物可用于治療癌癥、感染或感染性疾病，用作疫苗佐劑，和/或用于增加免疫細(xì)胞活性的方法中，包括向需要其的受試者施用治療有效量的所述藥物組合物。

54、在特定的實(shí)施方案中，這樣的藥物組合物進(jìn)一步包含抗犬pd-1抗體(包括犬源化鼠抗犬pd-1抗體)或其抗原結(jié)合片段。在更特定的實(shí)施方案中，所述抗犬pd-1抗體是犬源化鼠抗犬pd-1抗體或所述犬源化鼠抗犬pd-1抗體的抗原結(jié)合片段。

55、在相關(guān)的實(shí)施方案中，這樣的藥物組合物進(jìn)一步包含抗犬pd-l1抗體(包括犬源化鼠抗犬pd-l1抗體)或其抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施方案中，所述抗犬pd-l1抗體是犬源化鼠抗犬pd-1抗體或犬源化鼠抗犬pd-1抗體的抗原結(jié)合片段。

56、因此，本發(fā)明提供包含下述中的一種、兩種、三種或更多種的藥物組合物：抗犬pd-l1抗體、抗犬pd-1抗體、抗犬ctla-4抗體、抗犬pd-l1抗體的抗原結(jié)合片段、抗犬pd-1抗體的抗原結(jié)合片段或抗犬ctla-4抗體的抗原結(jié)合片段。在特定的實(shí)施方案中，這樣的抗犬蛋白(即，抗犬pd-l1、pd-1或ctla-4)抗體或其抗原結(jié)合片段是鼠抗犬蛋白抗體。在其它實(shí)施方案中，這樣的抗犬蛋白抗體或其抗原結(jié)合片段是犬源化抗犬蛋白抗體。在更特定的實(shí)施方案中，所述抗犬蛋白抗體或其抗原結(jié)合片段是犬源化鼠抗犬蛋白抗體。

57、此外，本發(fā)明提供增加免疫細(xì)胞的活性的方法，其包括向需要其的受試者施用治療有效量的本發(fā)明的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，所述方法用于治療癌癥。在其它實(shí)施方案中，所述方法用于治療感染或感染性疾病。在仍然其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的犬源化抗體或其抗原結(jié)合片段用作疫苗佐劑。在特定的實(shí)施方案中，包含犬源化鼠抗犬ctla-4抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物可以在犬源化鼠抗犬pd-1抗體或其抗原結(jié)合片段和/或犬源化鼠抗犬pd-l1抗體或其抗原結(jié)合片段之前、之后或同時(shí)施用。

58、通過(guò)參考以下附圖簡(jiǎn)述和詳細(xì)說(shuō)明將更好地理解本發(fā)明的這些和其它方面。