本發(fā)明屬于酶固定化領(lǐng)域，尤其涉及一種金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶固定化方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、將功能性蛋白質(zhì)與兼具編程性和識別能力的核酸偶聯(lián)所得到的蛋白-核酸偶聯(lián)物，已廣泛應(yīng)用于生物檢測、藥物遞送、分子生物學(xué)研究等領(lǐng)域。為了滿足諸多應(yīng)用的需求并實(shí)現(xiàn)高效偶聯(lián)，不僅需要蛋白質(zhì)與核酸分別具有可用的官能團(tuán)以及溫和的偶聯(lián)條件，并且形成偶聯(lián)物仍需具有游離蛋白質(zhì)的功能與活性。然而，核酸中額外官能團(tuán)的修飾增加偶聯(lián)成本；一些靠近或位于蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的非特異修飾，易使偶聯(lián)物失活。盡管，通過基因工程調(diào)控標(biāo)簽融合蛋白表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)精確控制偶聯(lián)的化學(xué)計(jì)量比和修飾的位置。但是，對特殊設(shè)備的需求和額外的化學(xué)反應(yīng)依然限制其廣泛應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是：為了解決現(xiàn)有功能性蛋白質(zhì)與核酸偶聯(lián)方法過程復(fù)雜、條件苛刻，難以保留蛋白質(zhì)的活性及功能等問題。本發(fā)明旨在提供一種金屬-g4zyme核酸框架介導(dǎo)的酶固定化方法，本發(fā)明在金屬離子與含g4dnazyme序列核酸存在條件下，通過仿生礦化實(shí)現(xiàn)酶與核酸的偶聯(lián)，所形成的功能性金屬核酸框架，兼具靶標(biāo)識別與信號放大的雙重功能，并實(shí)現(xiàn)小分子靶標(biāo)檢測應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶固定化方法，包括以下步驟：

3、步驟s1：將酶和含有g(shù)四鏈體的核酸序列在pbs緩沖溶液中共孵育，加入100-500mm的二價金屬離子，置于離心管中震蕩，室溫反應(yīng)一定時間后超聲，在10000rpm下離心去上清，用去離子水洗滌沉淀物3次，采用pbs緩沖溶液復(fù)溶沉淀后，得到功能性金屬核酸框架固定化酶備用；

4、步驟s2)：將制備好的功能性金屬核酸框架固定化酶，與高氯血紅素共孵育1h后，離心去上清，洗去多余的hemin，得到金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶，置于4℃下備用。

5、本發(fā)明還提供了一種金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶的應(yīng)用，用于恩諾沙星的電化學(xué)檢測。具體包括如下步驟：

6、步驟1)：制備金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶；

7、步驟2)：將玻碳電極進(jìn)行預(yù)處理；

8、步驟3)：將巰基修飾的恩諾沙星分裂適配體2在95℃下退火10min，退火后的2μm恩諾沙星分裂適配體2與預(yù)處理的玻碳電極共孵育3h，通過au-s鍵固定在電極上，然后與2mmmch共孵育1h封閉非特異性位點(diǎn)；

9、步驟4)：將步驟3)制備的恩諾沙星分裂適配體2修飾的玻碳電極與金屬核酸框架固定化酶和不同濃度恩諾沙星共孵育1h，通過靶標(biāo)與兩段分裂適配體形成“三明治”結(jié)構(gòu)；

10、步驟5)：將步驟4)制備的修飾電極進(jìn)行dpv檢測，以tmb和h2o2的混合溶液作為電催化底物，建立氧化形成的oxtmb電化學(xué)信號強(qiáng)度與恩諾沙星濃度的關(guān)系。

11、相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果：

12、1、“一鍋法”實(shí)現(xiàn)功能性金屬核酸框架固定化酶的制備，解決了現(xiàn)有功能性蛋白與核酸偶聯(lián)方法過程復(fù)雜、條件苛刻，難以保留蛋白質(zhì)的活性及功能的問題。

13、2、所得到的功能性金屬核酸框架固定化酶兼具具有靶標(biāo)特異性識別功能(適配體)和信號放大(酶和g4dnazyme)的雙重功能。

14、3、該策略可拓展其他酶的固定。

技術(shù)特征：

1.一種金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶固定化方法，其特征在于包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶固定化方法，其特征在于上述步驟s1中的酶包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、漆酶中的至少一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶固定化方法，其特征在于上述步驟s1中的pbs的ph濃度為6.8。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶固定化方法，其特征在于上述步驟s1中的二價金屬離子為ca2+、co2+、ni2+、zn2+、mn2+中的至少一種。

5.一種基于權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶的應(yīng)用，其特征在于用于恩諾沙星的電化學(xué)檢測。

6.根據(jù)權(quán)利要求6所述的金屬-g4dnazyme核酸框架介導(dǎo)的酶的應(yīng)用，其特征在于恩諾沙星的電化學(xué)檢測包括如下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種金屬?G4DNAzyme核酸框架介導(dǎo)的酶固定化方法與應(yīng)用。將酶和含有G四鏈體的核酸序列在PBS緩沖溶液中共孵育，加入二價金屬離子，置于離心管中震蕩后超聲，離心上清后去離子水洗滌，采用PBS緩沖溶液復(fù)溶沉淀后，與高氯血紅素共孵育，離心去上清，洗去多余的高氯血紅素，得到金屬?G4DNAzyme核酸框架介導(dǎo)的酶。本發(fā)明克服現(xiàn)有功能性蛋白質(zhì)與核酸偶聯(lián)方法過程復(fù)雜、條件苛刻，難以保留蛋白質(zhì)的活性及功能的問題。本發(fā)明通過仿生礦化實(shí)現(xiàn)酶與核酸的偶聯(lián)，所形成的功能性金屬核酸框架固定化酶，兼具靶標(biāo)識別與信號放的雙重功能，并將其應(yīng)用于小分子靶標(biāo)的檢測。

技術(shù)研發(fā)人員：徐斐,葉泰,岳淑瑩,袁敏,曹慧,于勁松,郝麗玲
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海理工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/28