本技術(shù)屬于生物防治方法領(lǐng)域，具體地說，尤其涉及一種抑制瓦螨寄生的生物防治方法。

背景技術(shù)：

1、狄斯瓦螨（ varroa?destructor，以下簡稱瓦螨）是一種蜜蜂體外寄生螨，蜜蜂的全球化貿(mào)易以及轉(zhuǎn)地養(yǎng)蜂，使得瓦螨在全球迅速傳播。瓦螨對西方蜜蜂危害最為嚴(yán)重，以蜜蜂血淋巴和脂肪體為食，使蜜蜂的脂肪和蛋白質(zhì)合成減少從而體重減輕，蜜蜂的體質(zhì)變?nèi)鯄勖兌?，同時還是傳播蜜蜂病毒的載體，因此瓦螨的防治在蜜蜂飼養(yǎng)過程中是必不可少的一環(huán)。

2、目前瓦螨的主要防治方法包括殺螨劑噴灑法、甲酸熏蒸法、精油消殺法等，殺螨劑噴灑法例如中國專利公開號為cn106163279a的專利文獻(xiàn)，其公開了長效殺螨劑組合物及其生產(chǎn)方法、殺螨劑條以及控制狄斯瓦螨螨蟲的方法，并具體公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：所述組合物包含草酸、甘油、四碳二羧酸和甲酸。cn106163279a號專利文獻(xiàn)還涉及在蜂箱中引入的嵌入在所述殺螨劑組合物中的纖維素條以及其生產(chǎn)方法。精油消殺法例如中國專利公開號為cn116211915a的專利文獻(xiàn)，其公開了一種香樟精油作為防治狄斯瓦螨藥物的應(yīng)用，并具體公開了香樟精油對狄斯瓦螨殺滅效果好，熏蒸毒性可穿透蠟蓋，無需對蜂群進(jìn)行囚王斷子即可治螨；揮發(fā)性強(qiáng)，蜂群內(nèi)蜂產(chǎn)品中殘留量低；此精油使狄斯瓦螨難以產(chǎn)生抗藥性；香樟精油成本低。

3、但是，現(xiàn)有技術(shù)中的治療方案在實際的使用中無法長期有效的應(yīng)用，且無法長期抑制瓦螨的寄生，且容易對飼養(yǎng)蜜蜂的周邊環(huán)境造成污染。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的在于提供一種抑制瓦螨寄生的生物防治方法，其為瓦螨防治提供了新的治療靶點，使用蜜蜂腸道工程菌建立新的質(zhì)粒傳遞dsrna途徑，顯著降低蜜蜂瓦螨的存活率，實現(xiàn)長期抑制瓦螨的寄生，降低現(xiàn)有方法對于周邊環(huán)境的污染。

2、為達(dá)到上述目的，本技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

3、本技術(shù)中所述的一種抑制瓦螨寄生的生物防治方法，該方法包括以下步驟：

4、s1、將基因序列seq?id?no.1所示的mrna片段作為幾丁質(zhì)合成酶1的表達(dá)基因、將基因序列seq?id?no.2所示的mrna片段作為幾丁質(zhì)合成酶2的表達(dá)基因，將基因序列seq?idno.3所示的mrna片段作為液泡型h+-atp酶1的表達(dá)基因，將基因序列seq?id?no.4所示的mrna片段作為液泡型h+-atp酶2的表達(dá)基因，通過酶切與質(zhì)粒載體pbtk800連接，得到構(gòu)建完成的pds- varroa質(zhì)粒，通過酶切插入pds- varroa質(zhì)粒的表達(dá)基因序列為seq?id?no.5所示；

5、s2、將步驟一中構(gòu)建完成的pds- varroa質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至蜜蜂腸道菌 s.?alvi中，獲得表達(dá)菌株 s.?alvi:?pds- varroa；

6、s3、對表達(dá)菌株 s.?alvi:?pds- varroa進(jìn)行擴(kuò)培，并定植于蜜蜂出房蜂；

7、s4、對步驟二中獲得的表達(dá)菌株 s.?alvi:?pds- varroa進(jìn)行定植穩(wěn)定性檢驗、瓦螨抑制效果實驗、表達(dá)效果檢驗中的一種或多種。

8、作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，本技術(shù)中所述的幾丁質(zhì)合成酶1的表達(dá)基因、幾丁質(zhì)合成酶2的表達(dá)基因、液泡型h+-atp酶1的表達(dá)基因、液泡型h+-atp酶2組合構(gòu)成的基因插入序列兩端添加酶切位點委托公司合成雙鏈dna片段，使用載體連接試劑盒實現(xiàn)與質(zhì)粒載體pbtk800的酶切和連接，以完成對pds- varroa質(zhì)粒的構(gòu)建。

9、作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，本技術(shù)中所述的步驟s2中pds- varroa質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至蜜蜂腸道菌 s.?alvi前，需要將蜜蜂腸道菌 s.?alvi轉(zhuǎn)變?yōu)楦惺軕B(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞采用如下方法制備：

10、s21、蜜蜂腸道菌 s.?alvi采用哥倫比亞血平板在35℃，5%co2的培養(yǎng)箱中分離西方蜜蜂腸道共生菌獲得，菌株為wkb2；

11、s22、將獲得的蜜蜂腸道菌 s.?alvi單菌落加入50ml哥倫比亞液體培養(yǎng)基中，在35℃，5%co2的培養(yǎng)箱中孵育48小時；

12、s23、在步驟s32培育完成后，在7000rpm、10min的條件下離心孵育液，收集細(xì)菌沉淀；

13、s24、將分離出的細(xì)菌沉淀采用高壓滅菌后的雙蒸水洗滌三次，最終使用1ml高壓滅菌的10%甘油重新懸浮細(xì)菌顆粒，每100μl分裝至一個離心管中，放置于-80℃冰箱保存。

14、作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，本技術(shù)中所述的步驟s2中pds- varroa質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至蜜蜂腸道菌 s.?alvi的電轉(zhuǎn)化方法為：所述電轉(zhuǎn)化流程包括從-80℃冰箱中取出100μl細(xì)菌溶液，加入500ng質(zhì)粒充分混勻，在冰上孵育20min，孵育完成后將75μl混合液加入到1mm的電轉(zhuǎn)杯中，使用bio-rad儀器，按照電壓1800v、電容25μf、電阻1ω的參數(shù)進(jìn)行電刺激后，將細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移至50ml哥倫比亞液體培養(yǎng)基中，在35℃、5%co2的培養(yǎng)箱中孵育過夜；孵育過夜后，將細(xì)菌細(xì)胞樣本在大觀霉素的哥倫比亞血平板上培養(yǎng)3天，獲取表達(dá)菌株 s.?alvi:pds- varroa，并將其保存在甘油中，置于-80℃冰箱保存。

15、作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，本技術(shù)中所述的步驟s4中的定植穩(wěn)定性檢驗包括獲取前期已經(jīng)驗證的且可穩(wěn)定表達(dá)的dsrna但不靶向宿主及寄生蟲基因的質(zhì)粒pds-gfp，將pds-gfp質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至蜜蜂腸道菌 s.?alvi中，以獲得工程菌 s.?alvi:?pds-gfp；采用抗生素處理后的出房蜂，設(shè)置兩個實驗組，分別為 s.?alvi:?pds- varroa接種組、 s.?alvi:?pds-gfp接種組，每天及時清理死亡蜜蜂，并在細(xì)菌定植后的第1天、第3天、第5天，從每個實驗組的每個飼喂杯中剖取相同數(shù)量蜜蜂的后腸組織，使用無菌pbs溶液研磨后梯度稀釋涂抹在含有大觀霉素的哥倫比亞血平板上，使用大觀霉素為60μg/ml，3天后統(tǒng)計cfu數(shù)量，統(tǒng)計及分析實驗數(shù)據(jù)以確定定植效果。

16、作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，本技術(shù)中所述的步驟s4中的瓦螨抑制效果實驗包括獲取前期已經(jīng)驗證的且可穩(wěn)定表達(dá)的dsrna但不靶向宿主及寄生蟲基因的質(zhì)粒pds-gfp，將pds-gfp質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至蜜蜂腸道菌 s.?alvi中，以獲得工程菌 s.?alvi:?pds-gfp；實驗采用經(jīng)過抗生素處理后的出房蜂，并分為三個處理組，分別為 s.?alvi:?pds- varroa接種組、 s.? alvi:?pds-gfp接種組以及蔗糖溶液處理組，接種后的蜜蜂轉(zhuǎn)移至飼喂杯中，飼喂2天后，三個處理組的蜜蜂分別被co2麻醉并重新在組內(nèi)分配飼喂杯，采用細(xì)尖毛刷在每只蜜蜂的體表均放置螨蟲；實驗過程中每天清理死蜂，并記錄蜜蜂和瓦螨的死亡數(shù)量，直至實驗進(jìn)行到第8天，統(tǒng)計及分析實驗數(shù)據(jù)以確定瓦螨抑制效果。

17、作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，本技術(shù)中所述的步驟s4中的表達(dá)效果檢驗包括在出房蜂第1天定植表達(dá)菌株 s.?alvi:?pds- varroa，在出房蜂第3天接種瓦螨；在接種后的第4天獲取活蜂身上仍存活的瓦螨，提取單個瓦螨rna，并對rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過熒光定量試劑盒檢驗瓦螨4個靶標(biāo)基因的相對表達(dá)量，統(tǒng)計及分析實驗數(shù)據(jù)以確定表達(dá)效果。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)的有益效果是：

19、本技術(shù)中所記載的表達(dá)菌株 s.?alvi:?pds-varroa能夠有效地穩(wěn)定定植在蜜蜂腸道中，并且能夠?qū)srna傳遞到瓦螨體內(nèi)，降低相應(yīng)基因的表達(dá)量，有效抑制瓦螨的寄生，避免現(xiàn)有技術(shù)中所采用的殺螨劑噴灑法、甲酸熏蒸法、精油消殺法等可能對蜜蜂飼養(yǎng)環(huán)境所造成的影響。