本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，特別涉及dicer及其調控mirna作為標志物在制備診斷、預防和/或治療腫瘤肝轉移的產品中的應用。

背景技術：

1、轉移是導致結直腸癌(colorectal?cancer,crc)死亡的主要原因，其中以肝轉移(colorectal?cancer?liver?metastasis，crlm)最為常見。盡管化療、分子靶向治療和免疫治療發(fā)展迅速，但crlm患者由于其特殊的肝臟微環(huán)境和免疫耐受特征，往往對上述治療應答不佳，生存預后極差。近年來，越來越多研究表明m2型腫瘤相關巨噬細胞(tumorassociatedmacrophages，tams)在crc發(fā)生發(fā)展、遠處轉移和治療應答中發(fā)揮關鍵作用。目前認為靶向調控tams來重塑腫瘤免疫微環(huán)境可能是抑制腫瘤進展、改善疾病預后的潛在新策略。盡管以tams為靶點的小分子藥物和單抗在多種腫瘤動物模型中取得不錯的治療效果，但是crlm中tams特異性靶點不明確、藥物靶向性差以及潛在靶點的不可成藥性等因素限制了相關藥物在crlm中的臨床應用。

2、mirna屬于非編碼小rna，它主要通過與靶mrna的3’非轉錄取(utrs)結合在轉錄后水平上誘導基因沉默以及在翻譯水平上抑制蛋白合成。目前研究表明mirna在巨噬細胞極化和功能中發(fā)揮重要作用。例如，研究顯示mir.155、mir-125a/b通過促進炎癥信號通路誘導巨噬細胞m1極化，而mir-146a、mir-187、mir-21、mir-147可以抑制巨噬細胞促炎癥信號通路中的正性調節(jié)而促進巨噬細胞向m2型極化。但單一mirna變化往往難以解釋巨噬細胞的功能和表型特征，因此深入闡明crlm中tams的mirna分子網絡至關重要。

3、dicer是一種高度保守的核糖核酸內切酶，能將轉錄而成的、經drosha酶初步處理的shrna(小發(fā)卡rna)剪切為sirna，或將mirna前體(pre-mirna)剪切為成熟mirna。研究表明dicer表達與巨噬細胞極化密切相關。目前尚未見dicer與腫瘤肝轉移預后相關的報到，也未見其作為結腸癌肝轉移治療靶標的報道。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了dicer及其調控mirna作為標志物在制備診斷、預防和/或治療腫瘤肝轉移的產品中的應用。本發(fā)明將包載sidicer1的m2pep-lnp進行體外轉染并經mirna測序和驗證，發(fā)現mir-148a-3p和mir-1981-5p可能是dicer調控巨噬細胞表型的潛在靶點。進一步使用mirna?mimics和inhibitor對上述兩種mirna進行功能驗證，結果發(fā)現mir-148a-3p和mir-1981-5p可能通過調控akt信號通路重編程m2型巨噬細胞。

2、為了實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術方案：

3、本發(fā)明提供了dicer及其調控mirna作為標志物在制備診斷、預防和/或治療腫瘤肝轉移的產品中的應用。

4、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述標志物在腫瘤肝轉移患者m2型巨噬細胞中表達水平高于m1型巨噬細胞。

5、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述調控mirna包括mir-1981-5p和/或mir-148a-3p。

6、本發(fā)明還提供了如下任意項在制備預防和/或治療腫瘤肝轉移的產品中的應用：

7、(i)、敲低dicer的表達；和/或

8、(ii)、下調所述dicer的調控mirna的表達；和/或

9、(iii)、所述調控mirna的抑制劑；

10、所述調控mirna包括mir-1981-5p和/或mir-148a-3p。

11、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述mir-1981-5p的抑制劑包括microfftmmmu-mir-1981-5p?inhibitor；所述mir-148a-3p的抑制劑包括microfftm?mmu-mir-148a-3p?inhibitor。

12、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述應用包括促進m2型巨噬細胞重編程為m1型巨噬細胞。

13、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述應用包括下調il-10、p－akt的表達，上調il－1β的表達。

14、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述腫瘤包括結直腸癌、乳腺癌、膽管癌、食管癌、膠質母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、胰腺癌、前列腺癌或肉瘤。

15、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述產品包括藥物、試劑、試劑盒、試紙或生物傳感器。

16、本發(fā)明還提供了敲低dicer表達的sirna，其特征在于，包括如下任意項：

17、(i)、正義鏈具有如seq?id?no:30所示的核苷酸序列；反義鏈具有如seq?id?no:31所示的核苷酸序列；或

18、(ii)、正義鏈具有如seq?id?no:32所示的核苷酸序列；反義鏈具有如seq?id?no:33所示的核苷酸序列；或

19、(iii)、正義鏈具有如seq?id?no:34所示的核苷酸序列；反義鏈具有如seq?id?no:35所示的核苷酸序列。

20、本發(fā)明還提供了用于檢測dicer、mir-1981-5p和/或mir-148a-3p的試劑在制備腫瘤肝轉移的診斷產品中的應用。

21、本發(fā)明還提供了試劑盒，包括逆轉錄mir-1981-5p和/或mir-148a-3p的引物，所述引物分別具有如seq?id?no:15、seq?id?no:16所示的核苷酸序列。

22、在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述試劑盒還包括擴增所述mir-1981-5p和/或mir-148a-3p的正向引物和反向引物；擴增所述mir-1981-5p的正向引物具有如seq?id?no:21所示的核苷酸序列，擴增所述mir-148a-3p的正向引物具有如seq?id?no:22所示的核苷酸序列，所述反向引物具有如seq?id?no:20所示的核苷酸序列。

23、本發(fā)明提供了如下有益效果：

24、本發(fā)明將包載sidicer1的m2pep-lnp進行體外轉染并經mirna測序和驗證，發(fā)現mir-148a-3p和mir-1981-5p可能是dicer調控巨噬細胞表型的潛在靶點。進一步使用mirnamimics和inhibitor對上述兩種mirna進行功能驗證，結果發(fā)現mir-148a-3p和mir-1981-5p可能通過調控akt信號通路重編程m2型巨噬細胞。

技術特征：

1.dicer及其調控mirna作為標志物在制備診斷、預防和/或治療腫瘤肝轉移的產品中的應用。

2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述調控mirna包括mir-1981-5p和/或mir-148a-3p。

3.如下任意項在制備預防和/或治療腫瘤肝轉移的產品中的應用：

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于，所述應用包括促進m2型巨噬細胞重編程為m1型巨噬細胞。

5.如權利要求3或4所述的應用，其特征在于，所述應用包括下調il-10、p－akt的表達，上調il－1β的表達。

6.如權利要求3至5任一項所述的應用，其特征在于，所述腫瘤包括結直腸癌、乳腺癌、膽管癌、食管癌、膠質母細胞瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、胰腺癌、前列腺癌或肉瘤。

7.敲低dicer表達的sirna，其特征在于，包括如下任意項：

8.用于檢測dicer、mir-1981-5p和/或mir-148a-3p的試劑在制備腫瘤肝轉移的診斷產品中的應用。

9.試劑盒，其特征在于，包括逆轉錄mir-1981-5p和/或mir-148a-3p的引物，所述引物分別具有如seq?id?no:15、seq?id?no:16所示的核苷酸序列。

10.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，還包括擴增所述mir-1981-5p和/或mir-148a-3p的正向引物和反向引物；擴增所述mir-1981-5p的正向引物具有如seq?id?no:21所示的核苷酸序列，擴增所述mir-148a-3p的正向引物具有如seq?id?no:22所示的核苷酸序列，所述反向引物具有如seq?id?no:20所示的核苷酸序列。

技術總結
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學領域，特別涉及Dicer及其調控miRNA作為標志物在制備診斷、預防和/或治療腫瘤肝轉移的產品中的應用。本發(fā)明通過體內外實驗發(fā)現敲低巨噬細胞中Dicer能夠重編程M2型巨噬細胞為M1型，抑制結腸癌細胞增殖。本發(fā)明將包載siDicer1的M2pep?LNP進行體外轉染并經miRNA測序和驗證，發(fā)現miR?148a?3p和miR?1981?5p可能是Dicer調控巨噬細胞表型的潛在靶點。進一步使用miRNA?mimics和inhibitor對上述兩種miRNA進行功能驗證，結果發(fā)現miR?148a?3p和miR?1981?5p可能通過調控Akt信號通路重編程M2型巨噬細胞。

技術研發(fā)人員：夏盛隆,高瑜振,徐正陽,丁寧
受保護的技術使用者：浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2