本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)，具體涉及一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

1、矽肺是一種由于長期暴露于大量可吸入的游離二氧化硅粉塵顆粒(＜5-10μm)引起的肺部疾病，其基本病理改變是以膠原纖維組織為主的矽肺結(jié)節(jié)和廣泛肺纖維化。其發(fā)病機制仍未明確，疾病進展過程中的機制也尚未闡明。

2、然而由于受傳統(tǒng)觀念的影響，大多數(shù)的患者并未意識到自己已經(jīng)患有嚴(yán)重的疾病，部分患者對于治療也并不積極，從而錯過了最佳的治療時機，給家庭和社會帶來了沉重的負擔(dān)。因此，如何提高早期硅肺診斷率，降低患者的死亡率和致殘率是我國目前迫切需要解決的問題。雖然目前的臨床檢測手段能夠?qū)崿F(xiàn)對于肺間質(zhì)和病變組織的病理學(xué)檢查，但均不能直接反映人體肺部組織受到損傷的程度以及其功能變化情況；其次，盡管有多種藥物用于抗硅肺，但是這些藥物大多作用較慢，而且存在一定的副作用；再者，目前的研究多以動物作為模型來驗證新型藥物的有效性，但實驗結(jié)果往往與實際應(yīng)用效果之間存在著較大的偏差。

3、目前大多數(shù)研究認為當(dāng)游離sio2顆粒進入肺泡后會引發(fā)下呼吸道炎性細胞浸潤，成纖維細胞異常增殖，肺泡上皮細胞表達釋放多種細胞因子，促進成纖維細胞增生和膠原沉積，可以轉(zhuǎn)分化為成纖維細胞，并在細胞因子刺激下向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致肺部纖維化病變。肺泡ii型上皮細胞作為肺泡主要結(jié)構(gòu)細胞，其具有調(diào)節(jié)表皮活性物質(zhì)代謝、肺泡環(huán)境的維持、肺損傷時向i型上皮的轉(zhuǎn)化的功能，廣泛參與肺部的炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)和損傷修復(fù)等多種生物學(xué)活動。在sio2顆粒的攻擊下，肺泡ii型上皮細胞凋亡或壞死的數(shù)量直接決定了sio2引起肺損傷的嚴(yán)重程度及預(yù)后走向。通過制備細胞模型，可以在體外利用sio2粉塵懸液刺激肺泡ii型上皮細胞，模擬體內(nèi)染塵環(huán)境，從細胞及分子層面探究矽肺的致病機制，尤其為研究細胞之間相互作用提供了更加直觀及便利的條件。

4、肺泡ⅱ型上皮細胞是分布于肺泡中的一種重要細胞，其主要功能是分泌肺表面活性物質(zhì)(pulmonary?surfactant，ps)，在維持肺泡功能和調(diào)節(jié)肺的血-氣交換等方面具有重要生理功能。肺表面活性物質(zhì)分布于肺泡上皮細胞的表面，是由肺泡的ⅱ型上皮細胞分泌的脂質(zhì)和表面活性蛋白組成的復(fù)合物，其中約90％為磷脂，約10％為表面活性蛋白。表面活性蛋白包括a、b、c、d四種類型，其中sp-c是高度特異于肺泡ii型上皮細胞的蛋白質(zhì)，是鑒定肺泡ⅱ型上皮細胞的重要標(biāo)志。肺表面活性物質(zhì)具有降低肺泡表面張力,維持肺泡大小，提高肺泡順應(yīng)性，防止肺不張和肺水腫等重要生理功能，對維持肺的正常生理功能起到至關(guān)重要的作用。

5、目前應(yīng)用于矽肺的肺泡上皮細胞模型，多選用a549細胞系。a549細胞系是一種廣泛使用的人肺腺癌細胞系，雖然其具有部分肺泡上皮特征，但是來源于原發(fā)性肺腫瘤，并不能完全模擬正常肺部微環(huán)境遭受游離sio2顆粒的即刻反應(yīng)及后續(xù)效應(yīng)。而從動物或者人體分離出來的原代細胞，標(biāo)本獲取困難且不容易在體外大量擴增，不利于實驗的重復(fù)驗證。目前已有利用永生化技術(shù)制備的永生化人肺泡ii型上皮細胞，但是尚缺乏應(yīng)用該細胞制備矽肺細胞模型的研究數(shù)據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為此，本發(fā)明提供一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，尤其是提供一種利用游離sio2顆粒誘導(dǎo)永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的建立方法，通過成功建立的體外矽肺模型，對于研究矽肺疾病的發(fā)生發(fā)展機制具有重要意義，為后續(xù)進一步研究細胞間相互作用及開發(fā)相關(guān)抗損傷藥物提供技術(shù)基礎(chǔ)及理論參考。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、根據(jù)本發(fā)明提供的一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，所述方法包括：

4、步驟一，矽塵處理

5、二氧化硅結(jié)晶標(biāo)準(zhǔn)品研磨后，利用無血清dmem培養(yǎng)基配置成母液，取母液及不含血清的dmem培養(yǎng)基配置sio2顆粒懸液；

6、步驟二，細胞處理

7、永生化人肺泡ii型上皮細胞原代培養(yǎng)后，進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)使用胰酶進行消化，待細胞形態(tài)變圓，角消失，加入培養(yǎng)基中止消化后進行后續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)期中的細胞，離心，使用完全培養(yǎng)基制備細胞懸液；調(diào)整細胞密度，將細胞接種于培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)至貼壁后，棄孔內(nèi)原有培養(yǎng)基，并用1×pbs清洗，隨后每孔加入sio2顆粒懸液，進行染毒培養(yǎng)，制備得到生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型。

8、進一步的，所述步驟二中，原代培養(yǎng)使用10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基。

9、進一步的，所述步驟二中，胰酶采用濃度為0.25％。

10、進一步的，所述步驟二中，完全培養(yǎng)基為10％胎牛血清+90％dmem。

11、進一步的，所述步驟二中，調(diào)整細胞密度為1×106/ml。

12、進一步的，所述步驟二中，sio2顆粒懸液濃度為75-150μg/ml，優(yōu)選75或150μg/ml。

13、進一步的，所述步驟二中，染毒培養(yǎng)時間6-12h。

14、進一步的，所述方法還包括將染毒培養(yǎng)后的細胞進行cck-8試劑染色，進行細胞活性檢測，孵育3h后觀察變色情況。

15、本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

16、本發(fā)明以永生化人肺泡ii型上皮細胞為研究對象，利用不同濃度sio2顆粒懸液染毒于永生化人肺泡ii型上皮細胞，通過檢測細胞活力確定最優(yōu)染毒時間和染毒濃度，成功建立了一種體外使用sio2顆粒懸液誘導(dǎo)永生化人肺泡ii型上皮細胞構(gòu)建矽肺模型的方法。該模型穩(wěn)定性好，易重復(fù)，為后續(xù)研究矽肺發(fā)生及發(fā)展機制和篩選差異分子，開發(fā)相關(guān)抗損傷藥物提供了技術(shù)基礎(chǔ)和理論參考。

技術(shù)特征：

1.一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟二中，原代培養(yǎng)使用10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟二中，胰酶采用濃度為0.25％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟二中，完全培養(yǎng)基為10％胎牛血清+90％dmem。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟二中，調(diào)整細胞密度為1×106/ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟二中，sio2顆粒懸液濃度75-150μg/ml。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟二中，染毒培養(yǎng)時間6-12h。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種永生化人肺泡ii型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法還包括將染毒培養(yǎng)后的細胞進行cck-8試劑染色，進行細胞活性檢測，孵育3h后觀察變色情況。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種永生化人肺泡II型上皮細胞矽肺模型的構(gòu)建方法，具體涉及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括：先進行矽塵處理再進行細胞原代處理和傳代培養(yǎng)；最后使用SiO<subgt;2</subgt;顆粒懸液，進行染毒培養(yǎng)，制備得到生化人肺泡II型上皮細胞矽肺模型。本發(fā)明以永生化人肺泡II型上皮細胞為研究對象，利用不同濃度SiO<subgt;2</subgt;顆粒懸液染毒于永生化人肺泡II型上皮細胞，通過檢測細胞活力確定最優(yōu)染毒時間和染毒濃度，成功建立了一種體外使用SiO<subgt;2</subgt;顆粒懸液誘導(dǎo)永生化人肺泡II型上皮細胞構(gòu)建矽肺模型的方法。

技術(shù)研發(fā)人員：周超
受保護的技術(shù)使用者：鄭州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9