本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，具體涉及一種生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的解脂耶氏酵母工程菌及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、解脂耶氏酵母（yarrowia?lipolytica）是一種安全級(jí)的非常規(guī)酵母，胞內(nèi)具有大量前體例如乙酰輔酶a可用于各種下游物質(zhì)的合成。又因該酵母是典型的產(chǎn)油微生物，三酰甘油（tag）的合成與代謝反應(yīng)活躍，進(jìn)而過(guò)氧化物酶體中的脂肪酸的β-氧化為乙醛酸循環(huán)提供了充足的乙酰輔酶a和還原力nadph，并促進(jìn)乙醛酸循環(huán)中間產(chǎn)物l-蘋(píng)果酸的生成。甘油作為一種無(wú)毒、廉價(jià)的可再生碳源，在解脂耶氏酵母中的代謝利于生產(chǎn)各種有價(jià)值的產(chǎn)品。

2、解脂耶氏酵母中l(wèi)-蘋(píng)果酸的代謝途徑存在三種，分別為線粒體中的tca循環(huán)途徑、胞質(zhì)中的rtca途徑、過(guò)氧化物酶體和胞質(zhì)中的乙醛酸循環(huán)途徑。在底物和底盤(pán)細(xì)胞β-氧化優(yōu)勢(shì)的加持下，過(guò)氧化物酶體中乙醛酸循環(huán)的l-蘋(píng)果酸的合成在異檸檬酸裂解酶、蘋(píng)果酸合酶、蘋(píng)果酸脫氫酶的共同作用下可高效獲得，如圖1所示。

3、l-蘋(píng)果酸（c4h6o5）又稱l-羥基丁二酸，是一種重要的四碳二元羧酸。其熔點(diǎn)約為47℃，沸點(diǎn)約為135℃，l-蘋(píng)果酸是一種白色結(jié)晶狀粉末，具有較強(qiáng)的吸濕性，在水中完全溶解且易溶于乙醇、氯仿，無(wú)致突變、致畸作用。早在1967?年被美國(guó)食品和藥品管理局登記確認(rèn)為一種安全、無(wú)毒、無(wú)害、可食用的有機(jī)酸，其允許攝入量（adi）不需特殊規(guī)定。因其舒適的酸度和柔和的味道而廣泛應(yīng)用于食品和飲料行業(yè)。此外還作為一種添加劑、抗氧化劑和消毒劑，為醫(yī)藥、化妝品和日?；瘜W(xué)品提供了非食品應(yīng)用。

4、l-蘋(píng)果酸的工業(yè)生產(chǎn)有化學(xué)合成和生物合成兩種方式，化學(xué)合成主要是利用石化資源而得，該方法對(duì)設(shè)備要求較高，對(duì)環(huán)境造成污染，使其在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中受到了限制。l-蘋(píng)果酸的生物合成方法則是通過(guò)對(duì)微生物代謝途徑的遺傳修飾來(lái)完成目標(biāo)產(chǎn)物的制備。其中，黃曲酶、黑曲霉、米曲酶、釀酒酵母、畢赤酵母等真菌天然生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的能力較強(qiáng)。然而，真菌具有菌絲表型，使其在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生高的肉湯粘度，這給常規(guī)攪拌槽發(fā)酵罐中的混合和通氣過(guò)程帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)。此外發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液呈現(xiàn)酸性，低ph環(huán)境影響菌株的性能。解脂耶氏酵母對(duì)酸性環(huán)境具有天然的較高耐受性，發(fā)酵周期短，發(fā)酵液處理更簡(jiǎn)便、回收率高，且尚未有應(yīng)用代謝工程改造解脂耶氏酵母發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是首次探究在解脂耶氏酵母中合成l-蘋(píng)果酸的潛力問(wèn)題，提供一株增強(qiáng)過(guò)氧化物酶體中乙醛酸循環(huán)的代謝流以及導(dǎo)入蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（spmae1）基因的解脂耶氏酵母工程菌，提高l-蘋(píng)果酸產(chǎn)量。

2、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之一，是一種采用解脂耶氏酵母生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的方法，所述方法是在解脂耶氏酵母宿主的過(guò)氧化物酶體中過(guò)表達(dá)異檸檬酸裂解酶（isocitratelyase，iclc）、蘋(píng)果酸合酶（malate?synthase，mse）、蘋(píng)果酸脫氫酶（malatedehydrogenase，mdhe2）實(shí)現(xiàn)的；

3、進(jìn)一步地，還在解脂耶氏酵母宿主中過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（spmae1）；

4、更進(jìn)一步地，所述解脂耶氏酵母宿主為解脂耶氏酵母（ yarrowia?lipolytica）po1gδku70；

5、更進(jìn)一步地，所述異檸檬酸裂解酶iclc，來(lái)源于解脂耶氏酵母，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；

6、更進(jìn)一步地，所述蘋(píng)果酸合酶mse，來(lái)源于解脂耶氏酵母，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

7、更進(jìn)一步地，所述蘋(píng)果酸脫氫酶mdhe2，來(lái)源于解脂耶氏酵母，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；

8、更進(jìn)一步地，所述蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白spmae1，來(lái)源于解粟酒裂殖酵母，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

9、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之二，是一種生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的解脂耶氏酵母工程菌，所述工程菌是在解脂耶氏酵母宿主的過(guò)氧化物酶體中過(guò)表達(dá)異檸檬酸裂解酶（isocitratelyase，iclc）、蘋(píng)果酸合酶（malate?synthase，mse）、蘋(píng)果酸脫氫酶（malatedehydrogenase，mdhe2），同時(shí)在胞質(zhì)中過(guò)表達(dá)蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（spmae1）獲得的；

10、進(jìn)一步地，所述解脂耶氏酵母宿主為解脂耶氏酵母（ yarrowia?lipolytica）po1gδku70；

11、進(jìn)一步地，所述異檸檬酸裂解酶iclc，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述蘋(píng)果酸合酶mse，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述蘋(píng)果酸脫氫酶mdhe2，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白spmae1，編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

12、更進(jìn)一步地，在脂耶氏酵母po1gδku70過(guò)氧化物酶體中分別過(guò)表達(dá)seq?id?no.1所示的異檸檬酸裂解酶iclc、seq?id?no.2所示蘋(píng)果酸合酶mse、seq?id?no.3所示蘋(píng)果酸脫氫酶mdhe2、以及在胞質(zhì)中過(guò)表達(dá)seq?id?no.4所述蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白spmae1，獲得一株生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的解脂耶氏酵母工程菌po1g-cee2+sp。

13、本發(fā)明提供的技術(shù)方案之三，是技術(shù)方案之二所述工程菌株的應(yīng)用，特別是在生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸中的應(yīng)用；

14、進(jìn)一步地，采用上述菌株在ypg培養(yǎng)基中好氧條件下合成l-蘋(píng)果酸的方法如下：

15、將解脂耶氏酵母工程菌株po1g-cee2+sp的種子液按1-1.2%接種量接種至ypd培養(yǎng)基中，30-32℃，200-220?rpm條件培養(yǎng)15-18?h，再按1.5-2%（v/v）接種量轉(zhuǎn)接至ypg培養(yǎng)基中30-32℃，200-220?rpm培養(yǎng)條件下發(fā)酵120?±?5?h。

16、所述ypg培養(yǎng)基組成成分為：蛋白胨18-22?g/l，酵母浸粉8-12?g/l，甘油90-110g/l，k2hpo40.15?g/l，kh2po40.15?g/l，caco340?g/l，余量為水，115-121℃，滅菌20?min。

17、進(jìn)一步地，發(fā)酵120?h后取樣，檢測(cè)l-蘋(píng)果酸的含量，搖瓶發(fā)酵下po1g-cee2+sp菌株發(fā)酵液中l(wèi)-蘋(píng)果酸含量達(dá)到37.0?g/l。

18、有益效果：

19、本發(fā)明以甘油為碳源并增強(qiáng)解脂耶氏酵母過(guò)氧化物酶體中的乙醛酸循環(huán)途徑的代謝流促進(jìn)l-蘋(píng)果酸的合成。此外，本發(fā)明還引入來(lái)自粟酒裂殖酵母的蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白spmae1，解除反饋抑制并加速產(chǎn)物外排。同時(shí)意外的發(fā)現(xiàn)，在原始菌株po1g?δku70的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)內(nèi)源基因iclc（異檸檬酸裂解酶）、mse（蘋(píng)果酸合酶）、mdhe2（蘋(píng)果酸脫氫酶）和異源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因spmae1之后獲得的po1g-cee2+sp菌株耐酸性相對(duì)于原始菌株從3.58提升至2.76，耐酸性的增強(qiáng)將有利于l-蘋(píng)果酸的生產(chǎn)。

20、結(jié)果表明，途徑基因過(guò)表達(dá)并引入異源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的工程菌株po1g-cee2+sp在ypg發(fā)酵條件下，l-蘋(píng)果酸產(chǎn)量為37.0?g/l?？梢?jiàn)，改造后的基因工程菌株，更適合工業(yè)應(yīng)用，可降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率。