本發(fā)明屬于微生物和基因工程，涉及一種產(chǎn)鼠李糖脂的基因工程菌、構(gòu)建方法及其在微生物發(fā)酵制備鼠李糖脂中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、鼠李糖脂(rhamnolipids，rl)是銅綠假單胞菌以多種疏水性或親水性碳源，在好氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)上主要由一個(gè)到兩個(gè)親水的鼠李糖單元和一條至兩條疏水的脂肪酸鏈組成，是一類具有無毒、環(huán)保、可生物降解和生物相容性等優(yōu)點(diǎn)的生物表面活性劑，是研究時(shí)間最長、應(yīng)用技術(shù)最為成熟的一種生物表面活性劑，廣泛應(yīng)用于石油開采、環(huán)境污染修復(fù)、農(nóng)業(yè)、化妝品等行業(yè)。因此鼠李糖脂的特性優(yōu)良、應(yīng)用前景廣闊。

2、雖然銅綠假單胞菌(pseudomonas?aeruginosa)具有高滴度合成鼠李糖脂的優(yōu)越能力，但是它是一種條件致病菌，生物安全性較差。伯克霍爾德菌是另一種天然鼠李糖脂生產(chǎn)菌株，由于其發(fā)酵期長和鼠李糖脂產(chǎn)量低，其發(fā)酵生產(chǎn)也受到限制。為了解決這一問題，惡臭假單胞菌作為安全菌株引起了研究人員對鼠李糖脂生物合成的關(guān)注。

3、惡臭假單胞菌kt2440(pseudomonas?putida?kt2440)是gras認(rèn)證環(huán)境安全的假單胞菌屬模式菌種，遺傳背景清晰，產(chǎn)物的生物合成過程不受細(xì)胞群體感應(yīng)的影響，具有出色的降解環(huán)境污染物以及在惡劣條件下的強(qiáng)大生存能力。同時(shí)也有著產(chǎn)物的生物合成過程不受細(xì)胞群體感應(yīng)影響的優(yōu)點(diǎn)，是生產(chǎn)鼠李糖脂的理想細(xì)胞底盤。鼠李糖脂的合成依賴于三條代謝途徑，分別為脂質(zhì)前體β羥基脂肪酸(haas)合成途徑、糖基前體dtdp-l-鼠李糖合成途徑以及將脂質(zhì)前體和糖基前體進(jìn)行聚合形成鼠李糖脂。目前惡臭假單胞菌來生產(chǎn)鼠李糖脂的主要問題是發(fā)酵產(chǎn)量不高，通用的做法是：通過代謝工程策略改造惡臭假單胞菌生產(chǎn)鼠李糖脂的策略主要通主要包括敲除冗余基因簇、合成啟動子文庫、異源表達(dá)rhlab、強(qiáng)化前體dtdp-l-鼠李糖的供應(yīng)等。然而，經(jīng)代謝工程處理的惡臭假單胞菌仍然存在一定的缺陷與問題，例如生物合成途徑的復(fù)雜性和鼠李糖脂前體供應(yīng)的不足導(dǎo)致產(chǎn)量不高的問題。。

4、因此，亟需構(gòu)建一種能促使惡臭假單胞菌高效表達(dá)鼠李糖脂的能力的基因工程菌。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明提出了一種產(chǎn)鼠李糖脂的基因工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的產(chǎn)鼠李糖脂的基因工程菌以惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag為底盤菌，過表達(dá)銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因以及惡臭假單胞菌基因組中的acca基因、accbc基因、accd基因、fabd基因中的一種或兩種以上的任意組合，以及使得惡臭假單胞菌中的鼠李糖脂產(chǎn)量提高，得到的基因工程菌發(fā)酵制備鼠李糖脂具有較高的效價(jià)。

2、本發(fā)明的目的之一提供了一種產(chǎn)鼠李糖脂的基因工程菌，其特征在于，包括底盤菌和導(dǎo)入底盤菌中滿足自我復(fù)制的重組質(zhì)粒；所述底盤菌為惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag；所述重組質(zhì)粒包含銅綠假單胞菌的rhlab基因以及惡臭假單胞菌基因組中的acca基因、accbc基因、accd基因、fabd基因中的一種或兩種以上的任意組合；所述rhlab基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述acca基因如核苷酸序列如seq?id?no.2所示；所述accbc基因如核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述accd基因如核苷酸序列如seq?id?no.4所示；所述fabd基因如核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

3、作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag是在敲除惡臭假單胞菌基因組中flag基因簇的突變株中過表達(dá)銅綠假單胞菌中的rhlab基因和rmlbdac基因獲得的重組菌株。

4、作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述rmlbdac基因如核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

5、作為本發(fā)明的優(yōu)選，本發(fā)明所述的惡臭假單胞菌的株型為惡臭假單胞菌kt2440。

6、作為本發(fā)明的優(yōu)選，本發(fā)明所述的銅綠假單胞菌的株型為銅綠假單胞菌pa01。

7、作為本發(fā)明的優(yōu)選，所述重組質(zhì)粒包含銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因以及惡臭假單胞菌基因組中的acca基因、accd基因、fabd基因。

8、或者，所述重組質(zhì)粒包含銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因以及惡臭假單胞菌基因組中的acca基因、accbc基因。

9、或者，所述重組質(zhì)粒包含銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因以及惡臭假單胞菌基因組中的acca基因、accbc基因、accd基因。

10、或者，所述重組質(zhì)粒包含銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因以及惡臭假單胞菌基因組中的acca基因、accd基因。

11、本發(fā)明的目的之二在于提供一種產(chǎn)鼠李糖脂的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

12、步驟1、制備惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag感受態(tài)；

13、步驟2、構(gòu)建重組質(zhì)粒pmk-ab-acca：采用一步克隆法在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因以及惡臭假單胞菌基因組中的acca基因、accbc基因、accd基因、fabd基因中的一種或兩種以上的任意組合，獲得重組質(zhì)粒；

14、步驟3、以惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag為底盤菌，過表達(dá)重組質(zhì)粒，獲得產(chǎn)鼠李糖脂的基因工程菌。

15、作為本發(fā)明的優(yōu)選，步驟1中制備惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag感受態(tài)，包括：

16、步驟1)敲除惡臭假單胞菌kt2440的flag基因簇，獲得基因敲除突變株kt2440δflag；

17、步驟2)將銅綠假單胞菌pa01中的rhlab基因和rmlbdac基因在基因敲除突變株kt2440△flag中過表達(dá)，獲得惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag。

18、作為本發(fā)明的優(yōu)選，步驟1)中敲除惡臭假單胞菌kt2440的flag基因簇采用的是利用同源重組的方法。

19、具體的，以惡臭假單胞菌kt2440基因組為模板，利用引物對p7/p8及p9/p10擴(kuò)增得到flag基因的上、下游同源臂片段，再利用引物p7/p10通過重疊pcr技術(shù)將兩個(gè)片段連接起來得到δflag片段；ppribmobsacb載體用hindiii、ecori進(jìn)行雙酶切，用c115連接酶將δflag片段與ppribmobsacb載體連接，獲得自殺載體pprib-δflag；通過電擊轉(zhuǎn)化的方式將自殺載體pprib-δflag導(dǎo)入惡臭假單胞菌kt2440感受態(tài)細(xì)胞中，通過慶大霉素和氨芐霉素共同篩選，得到基因敲除突變株kt2440δflag。

20、作為本發(fā)明的優(yōu)選，步驟2)中在基因敲除突變株中過表達(dá)銅綠假單胞菌pa01的關(guān)鍵基因步驟，包括：

21、以銅綠假單胞菌pao1為模板，利用引物對p21/p22，pcr擴(kuò)增得到的rmlbdac基因；

22、以pbbrimcs-ab-rmlbdac載體為模板，利用引物對p23/p24，pcr擴(kuò)增出載體骨架pbbrimcs-rhlab-p46，一步克隆后電轉(zhuǎn)至感受態(tài)基因敲除突變株kt2440δflag中，獲得基因工程菌rhlab-rmlbdac-δflag。

23、作為本發(fā)明的優(yōu)選，步驟3中以惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-δflag為底盤菌，過表達(dá)重組質(zhì)粒，包括：

24、制備惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag感受態(tài)細(xì)胞的步驟；以及

25、將測序正確的重組質(zhì)粒在1.2～1.5kv電壓下電轉(zhuǎn)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag感受態(tài)細(xì)胞的步驟。

26、具體的，所述基因工程菌包括：

27、在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca基因以及銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因，將載體導(dǎo)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中獲得的基因工程菌acca-pu；

28、在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)惡臭假單胞菌kt2440基因組中的accbc基因以及銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因，將載體導(dǎo)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中獲得的基因工程菌accbc-pu；

29、在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)惡臭假單胞菌kt2440基因組中的accd基因以及銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因，將載體導(dǎo)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中獲得的基因工程菌accd-pu；

30、在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)惡臭假單胞菌kt2440基因組中的fabd基因以及銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因，將載體導(dǎo)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中獲得的基因工程菌fabd-pu；

31、在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca和accbc基因以及銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因，將載體導(dǎo)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中獲得的基因工程菌accabc-pu；

32、在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca、accbc和accd基因以及銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因，將載體導(dǎo)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中獲得的基因工程菌accabcd-pu；

33、在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca、accd基因以及銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因，將載體導(dǎo)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中獲得的基因工程菌accad-pu；和/或

34、在表達(dá)載體pmk中過表達(dá)惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca、accd和fabd基因以及銅綠假單胞菌pao1基因組中的rhlab基因，將載體導(dǎo)入惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中獲得的基因工程菌accad-fabd-pu。

35、作為本發(fā)明的優(yōu)選，將惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca基因和銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因共同導(dǎo)入菌株惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中的方法為：

36、以銅綠假單胞菌pao1基因組為模板，用引物p1、p2為引物擴(kuò)增得到rhlab基因片段、用引物p3、p4為引物擴(kuò)增得到acca基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pmk(表達(dá)質(zhì)粒pmk需預(yù)先用ecori、kpni進(jìn)行雙酶切處理)一步克?。?/p>

37、將一步克隆后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)感受態(tài)惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中。

38、作為本發(fā)明的優(yōu)選，將惡臭假單胞菌kt2440基因組中的accbc基因和銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因共同導(dǎo)入菌株惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中的方法為：

39、以銅綠假單胞菌pao1基因組為模板，用引物p1、p2為引物擴(kuò)增得到rhlab基因片段、用引物p5、p6為引物擴(kuò)增得到accbc基因片段分別與表達(dá)質(zhì)粒pmk(表達(dá)質(zhì)粒pmk需預(yù)先用ecori、kpni進(jìn)行雙酶切處理)一步克隆；

40、將一步克隆后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)感受態(tài)惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中。

41、作為本發(fā)明的優(yōu)選，將惡臭假單胞菌kt2440基因組中的accd基因和銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因共同導(dǎo)入菌株惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中的方法為：

42、以銅綠假單胞菌pao1基因組為模板，用引物p1、p2為引物擴(kuò)增得到rhlab基因片段、用引物p7、p8為引物擴(kuò)增得到accd基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pmk(表達(dá)質(zhì)粒pmk需預(yù)先用ecori、kpni進(jìn)行雙酶切處理)一步克隆；

43、將一步克隆后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)感受態(tài)惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中。

44、作為本發(fā)明的優(yōu)選，將惡臭假單胞菌kt2440基因組中的fabd基因和銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因共同導(dǎo)入菌株惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中的方法為：以銅綠假單胞菌pao1基因組為模板，用引物p1、p2為引物擴(kuò)增得到rhlab基因片段、用引物p9、p10為引物擴(kuò)增得到fabd基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pmk(表達(dá)質(zhì)粒pmk需預(yù)先用ecori、kpni進(jìn)行雙酶切處理)一步克??；

45、將一步克隆后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)感受態(tài)惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中。

46、作為本發(fā)明的優(yōu)選，將惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca基因、accbc基因和銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因共同導(dǎo)入菌株惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中的方法為：

47、以銅綠假單胞菌pao1基因組為模板，用引物p1、p2為引物擴(kuò)增得到rhlab基因片段、用引物p3、p11為引物擴(kuò)增得到acca基因片段、用引物p12、p6為引物擴(kuò)增得到accbc基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pmk(表達(dá)質(zhì)粒pmk需預(yù)先用ecori、kpni進(jìn)行雙酶切處理)一步克??；

48、將一步克隆后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)感受態(tài)惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中。

49、作為本發(fā)明的優(yōu)選，將惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca基因、accbc基因、accd基因和銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因共同導(dǎo)入菌株惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中的方法為：

50、以銅綠假單胞菌pao1基因組為模板，用引物p1、p2為引物擴(kuò)增得到rhlab基因片段、用引物p3、p11為引物擴(kuò)增得到acca基因片段、用引物p12、p13為引物擴(kuò)增得到accbc基因片段、用引物p14、p8為引物擴(kuò)增得到accd基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pmk(表達(dá)質(zhì)粒pmk需預(yù)先用ecori、kpni進(jìn)行雙酶切處理)一步克?。?/p>

51、將一步克隆后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)感受態(tài)惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中。

52、作為本發(fā)明的優(yōu)選，將惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca基因、accd基因和銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因共同導(dǎo)入菌株惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中的方法為：

53、以銅綠假單胞菌pao1基因組為模板，用引物p1、p2為引物擴(kuò)增得到rhlab基因片段、用引物p3、p15為引物擴(kuò)增得到acca基因片段、用引物p16、p8為引物擴(kuò)增得到accd基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pmk(表達(dá)質(zhì)粒pmk需預(yù)先用ecori、kpni進(jìn)行雙酶切處理)一步克??；

54、將一步克隆后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)感受態(tài)惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中。

55、作為本發(fā)明的優(yōu)選，將惡臭假單胞菌kt2440基因組中的acca基因、accd基因、fabd基因和銅綠假單胞菌pa01的rhlab基因共同導(dǎo)入菌株惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中的方法為：

56、以銅綠假單胞菌pao1基因組為模板，用引物p1、p2為引物擴(kuò)增得到rhlab基因片段、用引物p3、p15為引物擴(kuò)增得到acca基因片段、用引物p16、p17為引物擴(kuò)增得到accd基因片段、用引物p18、p10為引物擴(kuò)增得到fabd基因片段與表達(dá)質(zhì)粒pmk(表達(dá)質(zhì)粒pmk需預(yù)先用ecori、kpni進(jìn)行雙酶切處理)一步克?。?/p>

57、將一步克隆后的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至電轉(zhuǎn)感受態(tài)惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag中。

58、本發(fā)明的目的之三在于提供了一種基因工程菌在微生物發(fā)酵制備鼠李糖脂中的應(yīng)用。

59、優(yōu)選的，所述應(yīng)用包括以下步驟：所述應(yīng)用包括以下步驟：將基因工程菌劃線于含有慶大霉素、氨芐霉素和卡那霉素的lb平板上，培養(yǎng)至長出單菌落，挑取單菌落接種到含有慶大霉素、氨芐霉素和卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，30℃、200rpm條件下過夜培養(yǎng)用作種子液；將種子液以體積濃度2％的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在ph自然、溫度為30℃的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā)酵液，分離提純得鼠李糖脂；其中，卡那霉素在培養(yǎng)基中終濃度為0.05mg/l；慶大霉素在培養(yǎng)基中終濃度為0.025mg/l，氨芐霉素在培養(yǎng)基中終濃度為0.1mg/l；所述發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖10g/l、酵母提取物5g/l、蛋白胨10g/l，氯化鈉10g/l，溶劑為去離子水，ph值自然。

60、本發(fā)明通過在惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag的基礎(chǔ)上通過異源過表達(dá)來自銅綠假單胞菌的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶亞基a基因rhla和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶亞基b基因rhlb；同時(shí)過表達(dá)鼠李糖脂合成途徑中的前體物質(zhì)3-羥基鏈烷?；?3-羥基鏈烷酸酯(haa)合成的相關(guān)酶即乙酰輔酶a羧基轉(zhuǎn)移酶acca基因、accbc基因、accd基因以及?；d體蛋白轉(zhuǎn)?；竑abd基因，使得鼠李糖脂產(chǎn)量進(jìn)一步提高。在菌株的代謝中，不同的代謝途徑之間存在非線性的關(guān)聯(lián)，以及輔因子的與主代謝途徑的競爭和協(xié)作關(guān)系。本發(fā)明提供的提高鼠李糖脂產(chǎn)量的基因工程菌acca-pu、accbc-pu、accd-pu和fabd-pu相比對照基因工程菌株rhlab-rmlbdac-△flag，其產(chǎn)量的均有提高，因此對于acca基因、accbc基因、accd基因和fabd基因進(jìn)行組合過表達(dá)。

61、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

62、(1)本發(fā)明通過在惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag的基礎(chǔ)上通過異源過表達(dá)來自銅綠假單胞菌pao1的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶亞基a基因rhla和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶亞基b基因rhlb；同時(shí)過表達(dá)鼠李糖脂合成途徑中的前體物質(zhì)3-羥基鏈烷?；?3-羥基鏈烷酸酯(haa)合成的相關(guān)酶即乙酰輔酶a羧基轉(zhuǎn)移酶acca、accbc、accd以及?；d體蛋白轉(zhuǎn)?；竑abd，使得鼠李糖脂產(chǎn)量進(jìn)一步提高；

63、(2)本發(fā)明提供的提高鼠李糖脂產(chǎn)量的基因工程菌accabc-pu，通過過表達(dá)acca和accbc基因增加鼠李糖脂合成前體haa的供應(yīng)，從而使鼠李糖脂的產(chǎn)量相比惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag提高了2.24倍；

64、(3)本發(fā)明提供的產(chǎn)鼠李糖脂的基因工程菌accabcd-pu，在accabc-pu的基礎(chǔ)上增加了accd基因的過表達(dá)，使得鼠李糖脂的產(chǎn)量相比惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag提高了1.85倍；

65、(4)本發(fā)明提供的產(chǎn)鼠李糖脂的基因工程菌accad-pu，在accabcd-pu的基礎(chǔ)上刪除了accbc基因的過表達(dá)，使得使得鼠李糖脂的產(chǎn)量相比惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag提高了2.5倍；

66、(5)本發(fā)明提供的提高鼠李糖脂產(chǎn)量的基因工程菌accad-fabd-pu，在accad-pu的基礎(chǔ)上增加了fabd基因的過表達(dá)，使得惡臭假單胞菌kt2440中的鼠李糖脂產(chǎn)量進(jìn)一步提高，相比惡臭假單胞菌rhlab-rmlbdac-△flag提高了2.93倍；

67、(6)本發(fā)明提供的基因工程菌應(yīng)用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，具有產(chǎn)量高、底物廉價(jià)、易分離的特點(diǎn)，具有工業(yè)化前景。