本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物，尤其涉及一種檢測變形鏈球菌的lf-rpa引物和探針、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

1、齲齒是口腔最常見的疾病，是細(xì)菌為主等多因素作用造成的牙體硬組織的慢性破壞性疾病。變形鏈球菌(streptococcus?mutans簡寫為sm)是齲齒的主要病原體之一，能夠通過粘附到牙體組織表面聚集、增殖、代謝形成細(xì)菌生物膜從而定植口腔致使齲齒發(fā)生。變形鏈球菌代謝糖產(chǎn)生葡聚糖，在葡聚糖的介導(dǎo)下變形鏈球菌黏附和聚集于牙面獲得性膜上形成菌斑生物膜，在生物膜環(huán)境中細(xì)菌產(chǎn)酸使牙面脫礦破壞，致使齲齒發(fā)生。

2、葡糖基轉(zhuǎn)移酶作為重要的變形鏈球菌致齲因子，在細(xì)菌附著和菌斑的形成中起著重要的作用，失活變形鏈球菌gtf基因會(huì)導(dǎo)致其蔗糖依賴的黏附明顯降低，生物膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，且致齲力也有不同程度的下降。在變形鏈球菌中至少包含3種，有g(shù)tfb編碼的gtf-1，gtfc編碼gtf-si，gtfd編碼的gtf-s。其中，有合成非水溶性葡聚糖能力的gtfb和gtfc對變形鏈球菌的黏附作用必不可少。

3、傳統(tǒng)的檢測及鑒定變形鏈球菌的方法分離和培養(yǎng)細(xì)菌，存在明顯的缺陷，不僅培養(yǎng)條件和操作復(fù)雜，檢測周期長，且特異性敏感性都受到很大的限制；隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，為人們提供多種特異、靈敏和快速的微生物檢測方法，例如elisa、westblot該方法較傳統(tǒng)方法有一定的提高，但是存在較高的假陽性率風(fēng)險(xiǎn)，臨床效果不佳；隨著近年來pcr診斷技術(shù)的進(jìn)步和成熟，pcr應(yīng)用于微生物定性和定量檢測領(lǐng)域越來越受到臨床研究的重視。例如：在專利cn1737161a通過多輪常規(guī)pcr來鑒定唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌；專利cn115927684a采用常見的rt-pcr對變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌、干酪乳桿菌同時(shí)對引起齲齒的病原體進(jìn)行快速檢測和篩查；專利cn105256048b通過多重pcr對口腔致病菌進(jìn)行檢測。但該類型pcr不僅操作復(fù)雜，還需要專門的實(shí)驗(yàn)室和昂貴的pcr儀，且需要花費(fèi)較長時(shí)間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的主要目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中pcr操作復(fù)雜且特異性和準(zhǔn)確性不高的技術(shù)問題。一種檢測變形鏈球菌的lf-rpa引物及探針，包括：

2、所述lf-rpa引物和探針為sm?gtfb基因特異性的引物及探針，所述gtfb基因的特異性引物包括正向引物和用生物素標(biāo)記的反向引物，所述正向引物選自正向引物1、正向引物2、正向引物6中的一種或幾種；

3、所述用生物素標(biāo)記的反向引物選自反向引物1、反向引物2、反向引物6中的一種或幾種；

4、所述正向引物1的堿基序列為：seq?id?no：1；

5、所述正向引物2的堿基序列為：seq?id?no：2；

6、所述正向引物6的堿基序列為：seq?id?no：3；

7、所述反向引物1的堿基序列為：seq?id?no：4；

8、所述反向引物2的堿基序列為：seq?id?no：5；

9、所述反向引物6的堿基序列為：seq?id?no：6；

10、所述探針的堿基序列為：seq?id?no：7。

11、所述探針由與目標(biāo)序列同源的寡核苷酸組成，其中5’端用地高辛標(biāo)記，3’端用阻斷聚合酶擴(kuò)增的基團(tuán)修飾，并對探針進(jìn)行四氫呋喃脫堿基位點(diǎn)修飾。

12、本發(fā)明涉及一種檢測變形鏈球菌的試劑盒，所述試劑盒由試劑盒a和試劑盒b組成，所述試劑盒a由rpa反應(yīng)混合液、rpa凍干粉組成，所述試劑盒b由樣本裂解液、稀釋液、加熱裝置、取樣器、檢測卡、干燥劑組成；所述rpa反應(yīng)混合液含有權(quán)利要求1或2所述的引物及探針、rpa溶解液、激活劑。

13、所述樣本裂解液為磷酸鹽緩沖液和6m的鹽酸胍，

14、所述樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液。

15、所述檢測卡包括pvc底板、樣品墊、試劑墊、nc膜和吸水紙，樣品墊、試劑墊、nc膜和吸水紙依次交錯(cuò)搭接后粘貼在所述的pvc底板上，組成試紙大板，切割成寬3～4mm的試劑條，安裝好外殼得到所述的檢測卡。

16、所述樣品墊為用含nah2po4、na2hpo4、nacl、pvp、tween-20、proclin300的溶液處理后，37℃烘干過夜。

17、所述試劑墊為用納米碳標(biāo)記的地高辛抗體和鼠igg，用稀釋液稀釋10倍后鋪于結(jié)合墊上，37℃烘干過夜。

18、所述nc膜為包被有相互平行的檢測線t線和質(zhì)控線c線，間隔距離為5mm，包被好后37℃烘干過夜。

19、本發(fā)明還涉及一種變形鏈球菌的lf-rpa檢測方法，包括以下步驟：

20、采用試劑盒中的采樣器從口腔中采集牙齦、牙斑和牙垢樣本，保證全方位的樣本采集，將采集的樣本置于樣本裂解液中混勻備用；

21、取上述采集的口腔樣本3ul，加入試劑盒中的rpa反應(yīng)混合液中混勻，加入rpa凍干粉中，溶解混勻后，45℃孵育25min；

22、反應(yīng)結(jié)束后取擴(kuò)增產(chǎn)物10ul滴加到樣本稀釋液中，混勻，再用大滴管滴加3～4滴至檢測卡的加樣孔中，等待5～10min觀察結(jié)果；

23、直接肉眼觀察顯色情況，如果試紙同時(shí)出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測線，表明該樣本含有變形鏈球菌，若只出現(xiàn)質(zhì)控線則為陰性，通過檢測線上納米碳顯色強(qiáng)弱，可判斷變形鏈球菌的含量，無論檢測線顯色強(qiáng)度如何，質(zhì)控線都應(yīng)當(dāng)顯黑色，質(zhì)控線上沒有顯色信號(hào)意味著測試無效，樣品必須重新測試。

24、本發(fā)明具有以下有益效果：

25、1、本專利選擇了變形鏈球菌的致齲因子葡糖基轉(zhuǎn)移酶gtfb基因來設(shè)計(jì)引物，引物和探針具有特異性，與口腔中常見的致齲菌遠(yuǎn)緣鏈球菌、干酪乳桿菌等沒有交叉性。

26、2、本專利采用了rpa等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，rpa是一種新型的核酸擴(kuò)增方法。它與常規(guī)的pcr相比，具有快速、靈敏、簡便等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)擺脫了價(jià)格昂貴的精密儀器和專業(yè)技術(shù)人員操作的限制，同時(shí)極大地縮短了核酸擴(kuò)增的時(shí)間，有助于提高口腔變形鏈球菌的檢出率和準(zhǔn)確率。

27、3、本專利試劑盒采用rpa等溫?cái)U(kuò)增與免疫層析相結(jié)合的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了核酸檢測結(jié)果的可視化，與常規(guī)的核酸瓊脂糖凝膠電泳相比，具有相同的效果，且可在5～10min內(nèi)獲得結(jié)果，極大地縮短了檢測時(shí)間，同時(shí)避免了核酸的污染，以及復(fù)雜的操作和凝膠成像儀的限制，解決了常規(guī)核酸檢測分析不適于普通實(shí)驗(yàn)室及家庭自測推廣應(yīng)用的問題。

技術(shù)特征：

1.一種檢測變形鏈球菌的lf-rpa引物及探針，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測變形鏈球菌的lf-rpa引物及探針，其特征在于，所述探針由與目標(biāo)序列同源的寡核苷酸組成，其中5’端用地高辛標(biāo)記，3’端用阻斷聚合酶擴(kuò)增的基團(tuán)修飾，并對探針進(jìn)行四氫呋喃脫堿基位點(diǎn)修飾。

3.一種檢測變形鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由試劑盒a和試劑盒b組成，所述試劑盒a由rpa反應(yīng)混合液、rpa凍干粉組成，所述試劑盒b由樣本裂解液、稀釋液、加熱裝置、取樣器、檢測卡、干燥劑組成；所述rpa反應(yīng)混合液含有權(quán)利要求1或2所述的引物及探針、rpa溶解液、激活劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測變形鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述樣本裂解液為磷酸鹽緩沖液和6m的鹽酸胍。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測變形鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述樣本稀釋液為磷酸鹽緩沖液。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測變形鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述檢測卡包括pvc底板、樣品墊、試劑墊、nc膜和吸水紙，樣品墊、試劑墊、nc膜和吸水紙依次交錯(cuò)搭接后粘貼在所述的pvc底板上，組成試紙大板，切割成寬3～4mm的試劑條，安裝好外殼得到所述的檢測卡。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測變形鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述樣品墊為用含nah2po4、na2hpo4、nacl、pvp、tween-20、proclin300的溶液處理后，37℃烘干過夜。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測變形鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑墊為用納米碳標(biāo)記的地高辛抗體和鼠igg，用稀釋液稀釋10倍后鋪于結(jié)合墊上，37℃烘干過夜。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種檢測變形鏈球菌的試劑盒，其特征在于，所述nc膜為包被有相互平行的檢測線t線和質(zhì)控線c線，間隔距離為5mm，包被好后37℃烘干過夜。

10.一種變形鏈球菌的lf-rpa檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種檢測變形鏈球菌的LF?RPA引物和探針、試劑盒及其檢測方法，包括LF?RPA引物和探針為SM?GTFB基因特異性的引物及探針，所述GTFB基因的特異性引物包括正向引物和用生物素標(biāo)記的反向引物，所述正向引物選自正向引物1、正向引物2、正向引物3中的一種或幾種；所述用生物素標(biāo)記的反向引物選自反向引物1、反向引物2、反向引物3中的一種或幾種。本發(fā)明引入了RPA等溫?cái)U(kuò)增并結(jié)合lateral?flow快速檢測技術(shù)。相較于常規(guī)核酸擴(kuò)增技術(shù)，本專利的試劑盒操作簡便，結(jié)果直觀，同時(shí)具有較高的特異性和準(zhǔn)確性。

技術(shù)研發(fā)人員：屈武斐,周麗,胡小龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上海八通生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30