本發(fā)明屬于固定化脂肪酶制備，具體涉及基于羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球的固定化脂肪酶及其制備與應用。

背景技術：

1、脂肪酶來源廣泛且具有特異的催化活性，是目前應用最廣泛的酶之一，除了在細菌、真菌、植物和高等動物中具有生物學功能外，在油脂加工、食品加工、皮革、紡織、洗滌劑、造紙、精細化學品合成、制藥、化妝品等行業(yè)作為生物催化劑受到廣泛關注。但是游離脂肪酶存在容易受到外界因素如溫度、ph值等變化而失活、難回收再利用等問題，而固定化酶技術可以有效解決上述問題。固定化脂肪酶既具有酶的催化特性，又有一般化學催化劑能回收、反復使用等優(yōu)點，其開發(fā)利用具有廣闊的應用前景。

2、固定化脂肪酶的性能與載體密切相關。殼聚糖具有良好生物相容性和生物可降解性、綠色安全無毒、對環(huán)境無污染，是常用的固定化酶載體。klein等人（carbohyd?polym,2016,?137:?184-190）用無毒的京尼平作為交聯(lián)劑，制備了活化的殼聚糖顆粒固定化β-半乳糖苷酶，通過優(yōu)化初始乳糖濃度、ph值和溫度，固定化酶催化制備半乳糖產率為30%。wang等人（european?food?research?and?technology,?2014,?239(6):?1051-1059）利用殼聚糖包覆磁性納米粒子，并使用戊二醛作為交聯(lián)劑活化載體固定化堿性蛋白酶，固定化酶的最適溫度和ph范圍較游離酶顯著增加，酶解大豆分離蛋白140?min，水解度為18.38%，高于游離酶的17.50%。monteiro等（monteiro?c?r?r?,lima?m?j?p?,pinheiro?b?b?,etal.immobilization?of?lipase?a?from?candida?antarctica?onto?chitosan-coatedmagnetic?nanoparticles[j].international?journal?of?molecular?sciences,2019,20(16):4018.）制備形成殼聚糖微球后利用交聯(lián)劑戊二醛將殼聚糖微球和脂肪酶共價連接，最大載酶量為84mg/g，循環(huán)使用8次后剩余48%的酶活。雖然殼聚糖對于不同生物酶均有良好固定化效果，但殼聚糖不溶于水，僅溶于ph值6.5以下的弱酸溶液，因此殼聚糖固定化脂肪酶時需先制備殼聚糖載體，再通過吸附法負載脂肪酶，導致載酶量較低。而羧甲基殼聚糖水溶性更好，可以利用原位包埋法將脂肪酶包埋在羧甲基殼聚糖微球內，以增加載酶量。但是，純殼聚糖微球和純羧甲基殼聚糖微球都存在機械性能差、易破碎的缺點，嚴重限制了固定化酶的工業(yè)應用，需要與其它增強材料進行復合以提高微球的力學性能，進而提高固定化酶耐用性。

3、另外，脂肪酶固定化過程中，疏水性載體材料與酶的相互作用對脂肪酶具有活化作用。這是由于游離脂肪酶的活性位點被疏水寡肽（通常稱為“蓋子”）覆蓋，阻礙活性位點與底物的接觸；當存在疏水載體界面時，相互作用使脂肪酶的蓋子打開，活性位點由封閉形式變?yōu)殚_放形式而提高催化酶活，因此脂肪酶在疏水載體上的界面吸附是制備高催化活性固定化脂肪酶的常用方法。

4、木質素是自然界中的第二大生物質資源，是由苯基丙烷單元組成的三維網狀結構天然聚合物，具有疏水性。根據(jù)脂肪酶的催化機理，木質素的疏水特性能通過界面激活作用顯著提升脂肪酶的催化活性。zhang等人（industrial?crops?and?products,?2023,?193:116241）利用來源于玉米芯殘渣的木質素作為載體固定化南極假絲酵母脂肪酶b，增強了載體與脂肪酶之間的疏水作用，使固定化酶在儲存20天后仍保持了77.0%的活性，在經歷5個循環(huán)使用后仍保持88.6%的初始活性。park等人（carbohydrate?polymers,?2015,?115:223–229）將褶皺假絲酵母脂肪酶固定在纖維素/木質素微珠上，與單一纖維素相比，木質素的加入顯著提高了固定化酶的穩(wěn)定性和活性。另一方面，木質素作為一種具有剛性結構的生物聚合物，其與水凝膠形成的交聯(lián)網絡能顯著提升水凝膠的機械強度。例如，gregorich等人（acs?applied?polymer?materials,?american?chemical?society,?2023,?5(1):201–213）合成了聚乙烯醇/木質素水凝膠復合材料，并發(fā)現(xiàn)木質素的加入顯著提升了復合材料的機械性能，儲能模量能顯著提高至原始值的860%。因此，木質素既可以提高脂肪酶的催化活性，又可以增強凝膠的力學性能。將木質素與羧甲基殼聚糖結合可能是增強羧甲基殼聚糖微球的力學性能、提高脂肪酶催化活性，制備全生物基酶固定化載體的有效途徑。

5、工業(yè)木質素以堿木質素、酶解木質素和木質素磺酸鹽為主。堿木質素和酶解木質素含有大量的官能團，如羥基、苯基、甲氧基、醚鍵、羧基等，但分子量較低，水溶性差，只能溶于堿性介質，在一定程度上限制了其應用。而木質素磺酸鹽具有非常好的親水性，可同時與羧甲基殼聚糖、脂肪酶溶解水中形成混合溶液，實現(xiàn)酶的原位包埋，但固定化酶在在水中使用時木質素磺酸鹽極易滲出。因此亟需開發(fā)羧甲基殼聚糖與木質素復合制備穩(wěn)定性高的固定化脂肪酶的新技術。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術的缺點和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種基于羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球的固定化脂肪酶的制備方法。

2、本發(fā)明采用氨基偶聯(lián)劑edc/nhs（edc為1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺，nhs為n-羥基琥珀酰亞胺）對木質素進行改性以及制備固定化酶。先通過對木質素進行胺化和羧基化獲得改性木質素，然后將羧甲基殼聚糖、改性木質素和脂肪酶混合水溶液形成油包水乳液，最后采用edc/nhs同時交聯(lián)羧甲基殼聚糖、改性木質素和脂肪酶實現(xiàn)微球制備和酶固定化。其中改性木質素具有良好水溶性可實現(xiàn)脂肪酶的原位包封，交聯(lián)成球后在使用中不會滲出，且其苯環(huán)疏水性有助于激發(fā)脂肪酶催化活性。

3、本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制得的高載酶量和催化活性、機械性能良好的固定化脂肪酶。

4、本發(fā)明的再一目的在于提供上述基于羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球的固定化脂肪酶的應用。

5、本發(fā)明目的通過以下技術方案實現(xiàn)：

6、一種基于羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球的固定化脂肪酶的制備方法，包括以下步驟：

7、（1）將木質素溶于堿溶液中，加入甲醛和胺化改性劑進行胺化反應得到胺化木質素；再加入氨基偶聯(lián)劑和羧基化改性劑進行羧基化反應，透析，干燥，得到胺化-羧基化改性木質素；

8、（2）將羧甲基殼聚糖、胺化-羧基化改性木質素、脂肪酶和水混合得到水相溶液；將水相溶液和含表面活性劑的油相混合，乳化，得到w/o乳液；

9、（3）往w/o乳液中滴加氨基偶聯(lián)劑溶液，室溫下交聯(lián)反應，靜置分層，取下層，洗滌、抽濾，得到基于羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球的固定化脂肪酶。

10、優(yōu)選地，步驟（1）所述木質素為堿木質素、酶解木質素和木質素磺酸鹽中的至少一種；進一步優(yōu)選為堿木質素、酶解木質素和木質素磺酸鈉中的至少一種；最優(yōu)選為堿木質素。

11、優(yōu)選地，步驟（1）所述堿溶液為氫氧化鈉溶液和氫氧化鉀溶液中的至少一種，所述堿溶液的濃度為1.0～4.0?mol/l；所述木質素在堿溶液中的濃度為20～60wt%；進一步優(yōu)選地，所述堿溶液的濃度為2～4.0?mol/l；所述木質素在堿溶液中的濃度為20～50?wt%。

12、優(yōu)選地，步驟（1）所述木質素、甲醛和胺化改性劑的質量比為1：（0.37～1.11）：（0.2～1.0）；進一步優(yōu)選地，所述木質素、甲醛和胺化改性劑的質量比為1：（0.555～1.11）：（0.2～1.0）。

13、優(yōu)選地，步驟（1）所述甲醛以甲醛溶液的形式加入，所述甲醛溶液的濃度為30～40wt%；更優(yōu)選為37?wt%。

14、優(yōu)選地，步驟（1）所述胺化改性劑為乙二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺、四乙烯五胺中的至少一種；進一步優(yōu)選為乙二胺和四乙烯五胺中的至少一種。

15、優(yōu)選地，步驟（1）所述胺化反應的溫度為60～90?℃，反應時間為1～4?h；進一步優(yōu)選地，所述胺化反應的溫度為70～80?℃，反應時間為1～2?h。

16、優(yōu)選地，步驟（1）所述氨基偶聯(lián)劑為edc/nhs（edc為1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺，nhs為n-羥基琥珀酰亞胺）。

17、優(yōu)選地，步驟（1）所述羧基化改性劑為乙二胺四乙酸、二乙烯三胺五乙酸中的至少一種；進一步優(yōu)選為乙二胺四乙酸。

18、優(yōu)選地，步驟（1）所述木質素、氨基偶聯(lián)劑和羧基化改性劑的質量比為1：（0.12～0.8）：（0.5～2.0）；氨基偶聯(lián)劑為edc/nhs，edc用量為100～400?mg/g木質素，nhs用量為0.2～1.0?mg/mg?edc，所述木質素和羧基化改性劑的質量比為1：（0.5～2.0）；進一步優(yōu)選地，所述木質素、氨基偶聯(lián)劑和羧基化改性劑的質量比為1：（0.15～0.2）：（0.5～2.0）；edc用量為100～300?mg/g木質素，nhs用量為0.5～1.0?mg/mg?edc；所述木質素和羧基化改性劑的質量比為1：0.5。

19、優(yōu)選地，步驟（1）所述羧基化反應的溫度為30～40?℃，時間為12～36?h；進一步優(yōu)選地，所述羧基化反應的溫度為30?℃，時間為24?h。

20、優(yōu)選地，步驟（1）所述透析指室溫下采用1000?da的透析袋透析5天。

21、優(yōu)選地，步驟（1）所述干燥為冷凍干燥。

22、優(yōu)選地，步驟（2）所述羧甲基殼聚糖質量占水相溶液的3.0～9.0?wt%；所述胺化-羧基化改性木質素質量占水相溶液的0.5～9.0?wt%；進一步優(yōu)選地，所述羧甲基殼聚糖質量占水相溶液的3.0～6.0?wt%；所述胺化-羧基化改性木質素質量占水相溶液的0.5～5.0wt%。

23、優(yōu)選地，步驟（2）所述脂肪酶為皺褶假絲酵母脂肪酶、黑曲霉脂肪酶和念珠菌脂肪酶中的至少一種；所述脂肪酶的用量為0.05～0.8?g/g羧甲基殼聚糖；進一步優(yōu)選地，所述脂肪酶的用量為0.4～0.6?g/g羧甲基殼聚糖。

24、優(yōu)選地，步驟（2）所述含表面活性的油相中，表面活性劑含量為0.5～3.0?wt%；進一步優(yōu)選地，所述表面活性劑含量為1.0～2.0?wt%。

25、優(yōu)選地，步驟（2）所述含表面活性的油相為液體石蠟、乙酸乙酯、十二烷和大豆油中的至少一種；更優(yōu)選為液體石蠟和大豆油中的至少一種。

26、優(yōu)選地，步驟（2）所述含表面活性的油相中，表面活性劑為司盤-80、司盤-60、蔗糖酯、吐溫-80、十二烷基硫酸鈉和十二烷基苯磺酸鈉中的至少一種；更優(yōu)選為司盤-80和吐溫-80中的至少一種。

27、優(yōu)選地，步驟（2）所述水相溶液和含表面活性劑的油相的質量比為1：2～1：10；進一步優(yōu)選地，所述水相溶液和油相的質量比為1：8～1：10。

28、優(yōu)選地，步驟（2）所述乳化的轉速為100～800?rpm，時間為10～120?min；進一步優(yōu)選地，所述乳化的轉速為500～600?rpm，時間為30～120?min。

29、優(yōu)選地，步驟（3）所述氨基偶聯(lián)劑溶液中的氨基偶聯(lián)劑為edc/nhs；所述氨基偶聯(lián)劑溶液用量為水相溶液的10～30?wt%；所述氨基偶聯(lián)劑溶液中edc濃度為2.5～25?wt%，nhs用量為0.2～1.0?mg/mg?edc；進一步優(yōu)選地，所述氨基偶聯(lián)劑溶液用量為水相溶液的20wt%；所述氨基偶聯(lián)劑溶液中edc濃度為2.5～25?wt%；nhs用量為0.5～0.8?mg/mg?edc。

30、優(yōu)選地，步驟（3）所述交聯(lián)反應的時間為1～6?h；進一步優(yōu)選為2～3?h。

31、優(yōu)選地，步驟（3）所述靜置分層的時間為5～30?min；進一步優(yōu)選為10?min。

32、優(yōu)選地，步驟（3）所述洗滌、抽濾為：加入水與石油醚混合液洗滌3～6次，其中水與石油醚體積比為1：1～5：1，再將復合微球固定化脂肪酶轉移至布氏漏斗中真空抽濾10～30min。

33、上述制備方法制得的一種基于羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球的固定化脂肪酶。

34、本發(fā)明所制備的固定化脂肪酶的羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球的粒徑為100～800μm。

35、上述一種基于羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球的固定化脂肪酶的應用。

36、本發(fā)明所制備的固定化脂肪酶的羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球作為生物催化劑中的應用。

37、優(yōu)選地，所述固定化脂肪酶的羧甲基殼聚糖/木質素交聯(lián)復合微球作為生物催化劑在制備食品、藥品、洗滌劑中的應用。

38、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點及有益效果：

39、1、本發(fā)明所制復合微球載酶量高。將脂肪酶、羧甲基殼聚糖、改性木質素交聯(lián)形成復合微球的同時將脂肪酶原位包埋在復合微球中，載酶量高，且脂肪酶與載體結合牢固，穩(wěn)定性好，不易從微球上脫落。

40、2、本發(fā)明所制微球力學性能良好。利用edc/nhs將高含量氨基和羧基的改性木質素與羧甲基殼聚糖相互交聯(lián)形成穿插網絡結構，增強復合微球力學性能，提高微球的重復使用性。

41、3、本發(fā)明所制載酶復合微球催化性能良好，木質素的疏水性有利于打開覆蓋著脂肪酶活性中心的“蓋子”，對提高脂肪酶催化性能有積極影響。

42、4、本發(fā)明所制備的微球粒徑可控，通過改變油水比、使用不同質量的表面活性劑和乳液剪切速率可實現(xiàn)復合微球的粒徑從100～800μm之間調控。