本發(fā)明涉及屬于分子生物學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種雙分裂適體探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、夾心免疫測定法是一種通用的檢測方法，其檢出限低、特異性高，具有廣泛的應(yīng)用前景。但是這種測定方法要求分析物至少具有兩個(gè)可以同時(shí)結(jié)合兩種抗體的表位。然而，由于尺寸有限，小分子通常被認(rèn)為是單價(jià)的，無法同時(shí)結(jié)合兩種抗體。因此，夾心免疫分析大多是用來檢測蛋白質(zhì)等大分子，而很難對分子量小于1000的小靶標(biāo)進(jìn)行檢測。與抗體相比，適體具有分子質(zhì)量小、分子修飾靈活、可在室溫下長期保存、變性和復(fù)性后可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，為克服抗體的局限性提供了可能性，在小分子檢測的特殊情況下，適體相對于抗體具有更大的優(yōu)勢，被認(rèn)為是抗體的有前途的替代品。適體識別是基于分子間作用力，例如靜電相互作用、氫鍵等，對小分子有很強(qiáng)的親和力和選擇性。但是適體由于其核苷酸序列過長，往往傾向于折疊成非特異的二級結(jié)構(gòu)，可能與其他物質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生假陽性或非特異性信號，這顯然不利于建立一個(gè)特異性強(qiáng)的檢測方法。其次，傳統(tǒng)的小分子適體只有一個(gè)結(jié)合表位甚至部分表位，這給設(shè)計(jì)同時(shí)具有捕獲功能和信號報(bào)告的夾心式傳感器帶來了挑戰(zhàn)。

2、為了解決上述完整適體的難點(diǎn)，提高適體的特異性和敏感性。科學(xué)家提出了分離式適體的概念，即創(chuàng)造性地將一個(gè)完整的適體分成兩個(gè)片段。分裂適體比完整適體序列更短，可以避免空間位阻的缺點(diǎn)。并且分裂適體由于缺乏二級結(jié)構(gòu)，在沒有靶標(biāo)存在時(shí)會分散，只有在靶標(biāo)存在時(shí)，適體才能夠重新組裝成與之特異性結(jié)合的完整復(fù)合物，這種技術(shù)能夠有效地避免假陽性或非特異性信號的產(chǎn)生。例如白云峰等人首次借助分裂適體的高特異性以及氧化石墨烯與設(shè)計(jì)的適體序列的兩種狀態(tài)之間獨(dú)特的相互作用，構(gòu)建了腺苷的開啟/猝滅熒光適體傳感器，檢測限為6μ(osypovaa,thakar?d,dejeu?j,et?al.sensor?basedon?aptamer?folding?to?detect?low-molecular?weight?analytes[j].analyticalchemistry,2015,87(15):7566-7574)。盡管該方法實(shí)現(xiàn)了簡單的檢測，但由于目標(biāo)輸入和信號輸出之間的比率為2:1，靈敏度較低。

3、與線性hcr相比，非線性雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nhcr)由于形成分支納米結(jié)構(gòu)而具有更高的擴(kuò)增效率，并且簡化了無酶操作。楊甜甜等人成功利用了適體鄰近雜交的特異性優(yōu)勢以及nhcr的高靈敏度開發(fā)了一種共定位觸發(fā)的dna納米組裝策略用于放大成像(qi?c,bingt,mei?h,et?al.g-quadruplex?aptamers?for?zeatin?recognizing[j].biosensors?andbioelectronics,2013.299(13):157-162.)。該方法在確保特異性的同時(shí)保證了更高的檢測靈敏度。

4、細(xì)胞外三磷酸腺苷(atp)和ade等ade衍生物因其在腫瘤間質(zhì)中的高濃度水平成為公認(rèn)的癌癥生化標(biāo)志物。在正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞外atp水平處于低nm水平，但在腫瘤基質(zhì)和附近區(qū)域增加至μm水平。癌細(xì)胞會整合激活(atp)和抑制(ade)信號通路，從而產(chǎn)生“最終”的ade衍生物濃度結(jié)果。ade作為人類腫瘤標(biāo)志物在正常人與癌癥患者體內(nèi)含量的差異。如ade在人體內(nèi)的正常含量為0.18μm-4.7μm，結(jié)直腸癌患者中的ade濃度是健康人的近3倍。然而，目前市售的ade衍生物檢測試劑盒的檢測限僅為微克級別，其檢測靈敏度無法滿足癌癥臨床監(jiān)測的需求，并且多是酶聯(lián)免疫檢測，操作過程復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)環(huán)境。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種高靈敏度的雙分裂適體探針及其應(yīng)用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種雙分裂適體探針，包括兩個(gè)分裂適體，分別為分裂適體1和分裂適體2，分裂適體1包括適體片段1和分裂引發(fā)劑1，分裂適體2包括適體片段2和分裂引發(fā)劑2，兩個(gè)適體片段來自一個(gè)完整的適體序列a；所述適體片段1和適體片段2具有識別目的靶標(biāo)的能力，所述分裂引發(fā)劑1和分裂引發(fā)劑2具有啟動(dòng)nhcr的功能。

4、該探針能夠特異性識別靶標(biāo)，在靶標(biāo)存在的情況下，探針能夠形成三明治結(jié)構(gòu)，使兩段相互獨(dú)立的引發(fā)劑彼此靠近，協(xié)同誘導(dǎo)非線性雜交鏈反應(yīng)(nonlinear?hybridizationchain?reaction，nhcr)，實(shí)現(xiàn)微量小分子檢測信號的二次或指數(shù)生長。與典型的nhcr的引發(fā)劑是完整的不同，本發(fā)明中的引發(fā)劑被分成兩部分，可以由ade共同誘導(dǎo)。因此，在沒有ade的情況下，它可以被有效地抑制。首先，可以通過將完整的適體序列切割成兩個(gè)片段來構(gòu)建分裂適體，然后與nhcr方法結(jié)合，以構(gòu)建簡便且通用的小分子檢測平臺。雙分裂適體探針由兩個(gè)序列組成，每個(gè)序列可以細(xì)分為具有不同功能的兩個(gè)片段，一個(gè)片段源自分裂適體，具有識別ade的能力，另一片段源自分裂引發(fā)劑以啟動(dòng)nhcr。在游離狀態(tài)下，兩個(gè)序列彼此分開，單獨(dú)的分裂引發(fā)劑不能啟動(dòng)nhcr，從而留下具有猝滅熒光的穩(wěn)定探針。但在ade存在的情況下，兩條分裂適體可以結(jié)合兩分子的ade，并根據(jù)“誘導(dǎo)契合效應(yīng)”重新組裝成特定的構(gòu)型。然后，雙分裂適體探針的識別驅(qū)動(dòng)重塑可以將兩段分裂引發(fā)劑拉近，作為完整的引發(fā)劑觸發(fā)nhcr過程。

5、在其中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，分裂適體1和分裂適體2的摩爾比例為1-2:1-2。

6、在其中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述適體片段2的序列如acctgggggagtat；分裂引發(fā)劑2的序列為gatcaagcagt；適體片段1的序列如tgcggaggaaggt；分裂引發(fā)劑1的序列為gtcgaagtagtt；適體序列a的序列為acctgggggagtattgcggaggaaggt。

7、分裂引發(fā)劑和適體片段之間不能相互干擾。

8、本發(fā)明還要求保護(hù)所述雙分裂適體探針在制備檢測腺苷或腺苷衍生物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

9、本發(fā)還要求保護(hù)所述雙分裂適體探針在制備檢測結(jié)直腸癌、前列腺癌或肺癌的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。

10、一種檢測腺苷或腺苷衍生物的試劑或試劑盒，每一份檢測量包括10μl?at1溶液，10μl?at2溶液，16.5μl?buffer，1μl?fa溶液，1μl?fb溶液，1.5μl?qa溶液，3μl?qb溶液，2μlaa溶液和4μl?ab溶液；

11、所述at1的序列如seq?id?no.1所示，所述at2的序列如seq?id?no.2所示，所述fa的序列如seq?id?no.3所示，所述fb的序列如seq?id?no.4所示，所述qa的序列如seq?idno.5所示，所述qb的序列如seq?id?no.6所示，所述aa的序列如seq?id?no.7-11所示，所述ab的序列如seq?id?no.12所示。

12、一種檢測結(jié)直腸癌、前列腺癌或肺癌的試劑或試劑盒，每一份檢測量包括10μlat1溶液，10μl?at2溶液，16.5μl?buffer，1μl?fa溶液，1μl?fb溶液，1.5μl?qa溶液，3μl?qb溶液，2μl?aa溶液和4μl?ab溶液；

13、所述at1的序列如seq?id?no.1所示，所述at2的序列如seq?id?no.2所示，所述fa的序列如seq?id?no.3所示，所述fb的序列如seq?id?no.4所示，所述qa的序列如seq?idno.5所示，所述qb的序列如seq?id?no.6所示，所述aa的序列如seq?id?no.7-11所示，所述ab的序列如seq?id?no.12所示。

14、在其中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述aa的序列如seq?id?no.8所示。

15、在其中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述at1溶液、at2溶液、fa溶液、fb溶液，qa溶液、qb溶液、aa溶液和ab溶液的溶劑均為buffer溶液。

16、在其中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述buffer溶液中包括：1ml?50×tae溶液，0.625ml?mg2+溶液，48.375ml水，ph為8.0。

17、在其中的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，at1溶液、at2溶液、fa溶液、fb溶液，qa溶液、qb溶液、aa溶液和ab溶液的濃度為0.5-1.0μm。

18、以下對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋：

19、本發(fā)明以腺苷(ade)為模型，設(shè)計(jì)了雙分裂適體探針。首先，可以通過將完整的適體序列切割成兩個(gè)片段來構(gòu)建分裂適體，然后與nhcr方法結(jié)合，以構(gòu)建簡便且通用的小分子檢測平臺。雙分裂適體探針由兩個(gè)序列組成，每個(gè)序列可以細(xì)分為具有不同功能的兩個(gè)片段，一個(gè)片段源自分裂適體，具有識別ade的能力，另一片源自分裂引發(fā)劑以啟動(dòng)nhcr。在游離狀態(tài)下，兩個(gè)序列彼此分開，單獨(dú)的分裂引發(fā)劑不能啟動(dòng)nhcr，從而留下具有猝滅熒光的穩(wěn)定探針。但在ade存在的情況下，兩條分裂適體可以結(jié)合兩分子的ade，并根據(jù)“誘導(dǎo)契合效應(yīng)”重新組裝成特定的構(gòu)型。然后，雙分裂適體探針的識別驅(qū)動(dòng)重塑可以將兩段分裂引發(fā)劑拉近，作為完整的引發(fā)劑觸發(fā)nhcr過程。因此，熒光探針(由熒光團(tuán)標(biāo)記的fa和fb)可以連續(xù)打開并產(chǎn)生具有激活熒光的分支裝熒光樹，使ade的檢測信號得到擴(kuò)增，如圖1所示。

20、本發(fā)明證明了在靶標(biāo)的觸發(fā)下，dna能夠在溶液中成功自組裝形成分子量更大的熒光樹，實(shí)現(xiàn)信號擴(kuò)增。在dna自組裝過程中，通過優(yōu)化輔助鏈a的鏈長，發(fā)現(xiàn)在原有基礎(chǔ)上減少1個(gè)堿基后，可以降低nhcr自組裝的背景信號。

21、構(gòu)建的三明治型熒光傳感器能夠成功應(yīng)用于ade的檢測，在0.01-100ng/ml濃度范圍內(nèi)，測得的熒光強(qiáng)度隨著ade的濃度的增加而增強(qiáng)，線性回歸方程為：y＝499.77x-323.9(r2＝0.9951)，線性良好，lod不高于5.23pg/ml，檢測時(shí)間不多于30min。與最近新報(bào)導(dǎo)的檢測ade的方法相比，仍然有著較高靈敏度和較短檢測時(shí)間的優(yōu)勢。并且已證實(shí)該方法能夠在復(fù)雜樣本中對ade進(jìn)行準(zhǔn)確定量。