本發(fā)明屬于基因工程，涉及一種基于深度學(xué)習(xí)改造的底物及輔底物利用效率提高的酶突變體。

背景技術(shù)：

1、蛋白質(zhì)作為生命系統(tǒng)的核心構(gòu)成要素，其結(jié)構(gòu)和功能的精準(zhǔn)理解至關(guān)重要。目前，蛋白質(zhì)工程在酶分子改良方面應(yīng)用廣泛，即通過(guò)對(duì)基因或者蛋白本身進(jìn)行修改或修飾以改變蛋白結(jié)構(gòu)從而實(shí)現(xiàn)酶功能的改造。蛋白質(zhì)工程主要用于酶的熱穩(wěn)定性、催化效率、底物特異性和極端環(huán)境耐受性等酶學(xué)性質(zhì)的設(shè)計(jì)和改造。由于人工智能技術(shù)飛速發(fā)展以及先進(jìn)算法不斷涌現(xiàn)，計(jì)算機(jī)輔助蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)改造得到了極大的重視和發(fā)展，成為蛋白質(zhì)工程新開(kāi)辟的重要方向。得益于計(jì)算機(jī)計(jì)算能力的提升和大規(guī)模數(shù)據(jù)集的可用性，當(dāng)前深度學(xué)習(xí)發(fā)展迅猛，在復(fù)雜酶結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與穩(wěn)定性、選擇性、催化活性指導(dǎo)酶設(shè)計(jì)等問(wèn)題中表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，為酶分子設(shè)計(jì)提供了新的可能。

2、依托深度學(xué)習(xí)結(jié)合口袋塑造的酶改造策略可用于多種酶的改造，提升其酶活，提高對(duì)應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化效率。d型氨基酸氧化酶(daao)可用于草銨膦的制備。草銨膦(glufosinate?ammonium?phosphinothricin簡(jiǎn)稱ppt)，化學(xué)名稱為(d，l)-2-氨基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸，是世界三大除草劑(百草枯，草甘膦，草銨膦)之一。因草銨膦具有低毒、殺草譜廣、持效期長(zhǎng)、活性高及環(huán)境相容性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于農(nóng)田作物、非耕地、免耕地等雜草防治，具有較大市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。草銨膦是一種外消旋混合物，有l(wèi)-型和d-型兩種對(duì)映異構(gòu)體，但是在除草中起作用的只有l(wèi)-型的草銨膦，而d-型對(duì)映異構(gòu)體則無(wú)除草活性。因此，d-型草銨膦轉(zhuǎn)變成l-型草銨膦將大大減少原藥用量，這對(duì)于提高產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)性、減少農(nóng)藥使用量、減輕環(huán)境壓力都具有十分重要的作用。

3、目前，去除d-草銨膦最廣泛的方法是以d,l-草銨膦為原料，經(jīng)d-氨基酸氧化酶催化d-草銨膦得到l-草銨膦前體2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸，再經(jīng)氨基酸脫氫酶或轉(zhuǎn)氨酶催化得到l-草銨膦。因?yàn)閐-氨基酸氧化酶的高度選擇特異性，此法不僅可以有效去除d-草銨膦，其關(guān)鍵中間體2-羰基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸還可以進(jìn)一步被轉(zhuǎn)化為l-草銨膦，有效提高原子利用率。因此，篩選高產(chǎn)2-羰基-4-[羥基(甲基)膦酰基]丁酸突變株就顯得尤為重要。

4、腈水解酶(nitrilase?ec3.5.5.1)是一類能將腈類物質(zhì)(含有-cn)直接水解為相應(yīng)的羧酸的酶。腈水解酶的催化反應(yīng)具有高選擇性，催化速率高，反應(yīng)條件溫和以及對(duì)環(huán)境污染小等特點(diǎn)，是一種對(duì)環(huán)境友好的綠色合成方法，對(duì)節(jié)能減排具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。腈水解酶(ec?3.5.5)是腈酶超家族中的一種酶，它可以在一步反應(yīng)中將一系列腈催化成相應(yīng)的羧酸并釋放氨。腈水解酶介導(dǎo)的生物催化反應(yīng)具有環(huán)境溫和、環(huán)境友好、無(wú)副產(chǎn)物產(chǎn)生、產(chǎn)物具有優(yōu)異的區(qū)域選擇性、化學(xué)選擇性和立體選擇性等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)化學(xué)途徑所需要苛刻的酸堿反應(yīng)條件和產(chǎn)生不良副產(chǎn)物相比，腈水解酶在精細(xì)化工生產(chǎn)中有望成為傳統(tǒng)化學(xué)途徑的替代品。腈水解酶在催化產(chǎn)生煙酸、(r)-扁桃酸、丙烯酸、乙醇酸、1,5-二甲基-2哌啶酮、阿托伐他汀、加巴噴丁、(r)-巴氯芬和(s)-普瑞巴林等有價(jià)值的精細(xì)化學(xué)品中已有所應(yīng)用。

5、普侖司特(pranlukast)是一種口服支氣管哮喘治療藥物，屬于白三烯(cyslts)受體拮抗劑，能夠有效抑制ltd4受體從而治療哮喘。3-氨基-2-羥苯乙酮，英文名為1-(3-amino-2-hydroxyphenyl)ethanone(簡(jiǎn)稱3ahap)，是合成普侖司特的關(guān)鍵中間體。3-氨基-2-羥苯乙酮的生物合成依靠多酶體系催化，并適合于體外多酶催化。硝基還原酶(nbza)是一類分布廣泛的黃素蛋白酶，與輔基fmn或fad分子結(jié)合，以輔酶nad(p)h作為電子供體催化硝基基團(tuán)生成相應(yīng)的羥胺或氨基基團(tuán)。3-氨基-2-羥苯乙酮的生物合成反應(yīng)以輔酶循環(huán)nadph-gdh作為氫供體，首先經(jīng)硝基還原酶(nbza)催化底物間硝基苯乙酮的硝基還原為羥氨基，然后經(jīng)羥胺苯變位酶(haba)催化羥胺基重排生成3ahap。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了提高制備l-草銨膦的效率，本發(fā)明提供了一種基于深度學(xué)習(xí)改造的底物及輔底物利用效率提高的酶突變體。本發(fā)明基于深度學(xué)習(xí)改造，同時(shí)突變l55k、v94r、s233r得到的d型氨基酸氧化酶a0a499ub99突變體，可以對(duì)氧氣進(jìn)行高效利用，底物及輔底物利用效率提高，同時(shí)，酶活性有顯著提升，其應(yīng)用于生物催化外消旋ppt制備l-草銨膦前體2-羰基-4[羥基(甲基)膦酰基]丁酸(ppo)，具有較高的生產(chǎn)效率。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種氧氣利用率高的d型氨基酸氧化酶突變體，其特征在于：氨基酸序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明基于深度學(xué)習(xí)改造，以d型氨基酸氧化酶a0a499ub99為母本，經(jīng)過(guò)mutprop設(shè)計(jì)獲得d型氨基酸氧化酶突變體a0a499ub99-m3。d型氨基酸氧化酶突變體a0a499ub99-m3是通過(guò)對(duì)d型氨基酸氧化酶a0a499ub99同時(shí)突變leu55、val94、ser233三個(gè)位點(diǎn)后得到，突變?yōu)椋簂55k、v94r、s233r。經(jīng)過(guò)同時(shí)突變l55k、v94r、s233r得到的d型氨基酸氧化酶a0a499ub99突變體可以對(duì)氧氣進(jìn)行高效利用，大大提高生產(chǎn)制備l-草銨膦前體2-羰基-4[羥基(甲基)膦酰基]丁酸的效率。

5、第二方面，本發(fā)明提供了一種氧氣利用率高的d型氨基酸氧化酶突變體的編碼基因。

6、具體地，本發(fā)明給出了一種氧氣利用率高的d型氨基酸氧化酶突變體的編碼基因的核苷酸序列，如seq?id?no.2所示。

7、第三方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，所述重組載體包含上述編碼基因。

8、第四方面，本發(fā)明提供了一種基因工程菌，所述工程菌包含上述編碼基因或上述重組載體。

9、作為優(yōu)選，所述基因工程菌的宿主菌為大腸桿菌。

10、進(jìn)一步優(yōu)選，所述重組載體為pcdf-duet，所述大腸桿菌為大腸桿菌bl21(de3)。

11、第五方面，本發(fā)明提供了d型氨基酸氧化酶突變體或上述基因工程菌在制備l-草銨膦中的應(yīng)用。

12、具體地，應(yīng)用于生物催化外消旋ppt制備l-草銨膦前體2-羰基-4[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸(ppo)。

13、經(jīng)過(guò)同時(shí)突變l55k、v94r、s233r得到的d型氨基酸氧化酶a0a499ub99突變體，可以對(duì)氧氣進(jìn)行高效利用，同時(shí)，酶活性有顯著提升，提升了突變體生物催化外消旋ppt制備l-草銨膦前體2-羰基-4[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸的潛力。

14、第六方面，本發(fā)明提供了一種腈水解酶突變體，該腈水解酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.3所示，核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

15、第七方面，本發(fā)明提供了一種硝基還原酶突變體，該硝基還原酶突變體的氨基酸序列如seq?id?no.5所示，核苷酸序列如seq?id?no.6所示。

16、基于深度學(xué)習(xí)改造的方法，對(duì)腈水解酶、硝基還原酶進(jìn)行改造、突變，也能在使得底物及輔底物的利用效率提高，有利于在1-氰基環(huán)己基乙酸和3-氨基-2-羥基苯乙酮的合成中的應(yīng)用。

17、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

18、(1)本發(fā)明基于深度學(xué)習(xí)改造，以d型氨基酸氧化酶a0a499ub99為母本，經(jīng)過(guò)mutprop設(shè)計(jì)獲得d型氨基酸氧化酶突變體a0a499ub99-m3。d型氨基酸氧化酶突變體a0a499ub99-m3是通過(guò)對(duì)d型氨基酸氧化酶a0a499ub99同時(shí)突變leu55、val94、ser233三個(gè)位點(diǎn)后得到，突變?yōu)椋簂55k、v94r、s233r。經(jīng)過(guò)同時(shí)突變l55k、v94r、s233r得到的d型氨基酸氧化酶a0a499ub99突變體可以對(duì)氧氣進(jìn)行高效利用，同時(shí)，酶活性有顯著提升，因此可以大大提高生產(chǎn)制備l-草銨膦前體2-羰基-4[羥基(甲基)膦?；鵠丁酸的效率。

19、(2)本發(fā)明提供的d型氨基酸氧化酶a0a499ub99突變體可用于微生物催化制備l-ppt，利于工業(yè)化生產(chǎn)，具有較好應(yīng)用前景。