本技術(shù)涉及細胞培養(yǎng)，具體涉及一種將體細胞誘導為多能干細胞的方法及多能干細胞。

背景技術(shù)：

1、在生物體的發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持以及疾病進程中，細胞身份的動態(tài)變化緊密依賴于來自微環(huán)境的復雜外部信號。這些信號不僅塑造了細胞的初始身份，還持續(xù)調(diào)控其維持與轉(zhuǎn)變。在植物界及部分無脊椎動物中，外界環(huán)境的刺激能夠直接激發(fā)細胞分化與再生的能力，展現(xiàn)了驚人的可塑性。然而，對于哺乳動物細胞，尤其是高度分化的人類體細胞而言，僅依賴外部擾動來喚醒其可塑性潛力則顯得尤為艱難。

2、近年來，為了克服這一難題，科學家們利用小分子化合物作為化學擾動工具，成功地將小鼠體細胞誘導為具有多能性的干細胞。這一發(fā)現(xiàn)不僅驗證了化學物質(zhì)在細胞命運重編程中的潛力，還揭示了通過調(diào)控多個細胞信號通路及染色質(zhì)狀態(tài)來精確操縱細胞命運的可行性。盡管如此，要實現(xiàn)人類體細胞高效且穩(wěn)定地重編程為多能細胞，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。

3、因此，需要繼續(xù)開發(fā)一種用于將人類體細胞誘導重編程為多能性干細胞的新型小分子組合物，實現(xiàn)人類體細胞向多能性干細胞的高效、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了提高人類體細胞向多能細胞轉(zhuǎn)化的效率與穩(wěn)定性，本技術(shù)提供一種將體細胞誘導為多能干細胞的方法及多能干細胞。

2、第一方面，本技術(shù)提供一種將體細胞誘導為多能干細胞的方法，采用如下的技術(shù)方案：

3、一種將體細胞誘導為多能干細胞的方法，包括以下步驟：

4、依次采用i號培養(yǎng)基、ii號培養(yǎng)基、iii號培養(yǎng)基及iv號培養(yǎng)基對體細胞進行誘導培養(yǎng)，獲得多能干細胞；

5、所述i～iv號培養(yǎng)基均采用dmem高糖培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

6、所述i號培養(yǎng)基和ii號培養(yǎng)基均包括以下組分：視黃酸受體激動劑、糖原激酶抑制劑、tgfβ抑制劑、細胞骨架重排相關(guān)的卷曲螺旋的蛋白激酶的選擇性抑制劑、受體酪氨酸激酶抑制劑、smo激動劑、janus激酶1和janus激酶2抑制劑、menin-mll相互作用抑制劑；

7、所述視黃酸受體激動劑為bms961，

8、所述糖原激酶抑制劑為chir?98014，

9、所述tgfβ抑制劑為sb-431542，

10、所述細胞骨架重排相關(guān)的卷曲螺旋的蛋白激酶的選擇性抑制劑為y27632，

11、所述受體酪氨酸激酶抑制劑為rg3635，

12、所述smo激動劑為cyclopamine，

13、所述janus激酶1和janus激酶2抑制劑為baricitinib，

14、所述menin-mll相互作用抑制劑為mi503。

15、本技術(shù)提供了一種將體細胞誘導為多能干細胞的方法，該方法采用i～iv號培養(yǎng)基對人類體細胞依次進行誘導培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的多個關(guān)鍵信號通路及染色質(zhì)修飾過程，從而打破細胞原有的命運限制，促進其高效、穩(wěn)定地向多能狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。其中，采用i號培養(yǎng)基進行第一階段培養(yǎng)，能夠使體細胞轉(zhuǎn)化為單層上皮樣細胞；采用ii號培養(yǎng)基進行第二階段培養(yǎng)，能夠生產(chǎn)出具有再生程序的可塑性狀態(tài)細胞；采用iii號培養(yǎng)基進行第三階段培養(yǎng)，能夠建立初始多能性網(wǎng)絡(luò)，形成胚外內(nèi)胚層特性，獲得胚外內(nèi)胚層特性樣細胞；采用iv號培養(yǎng)基進行第四階段培養(yǎng)，能夠完全建立多能性網(wǎng)絡(luò)，獲得原代多能干細胞。綜上，本技術(shù)提供的將體細胞誘導為多能干細胞的方法具有成本低、操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，為細胞命運重編程領(lǐng)域提供了新思路與工具，從而能夠推動再生醫(yī)學、疾病模型構(gòu)建及藥物篩選等領(lǐng)域的發(fā)展。

16、可選地，所述i號培養(yǎng)基還包括以下組分：fbs、glutamaxtm、neaa、青霉素-鏈霉素、2-巰基乙醇、vc、尼克酰胺、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、s-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑；

17、所述組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑為epz004777，所述s-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑為3-去氮腺嘌呤a。

18、可選地，所述ii號培養(yǎng)基還包括以下組分：fbs、glutamaxtm、neaa、青霉素-鏈霉素、2-巰基乙醇、vc、nam、bfgf、c-jun激酶抑制劑、dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、單胺氧化酶抑制劑、ehmt2抑制劑、bmp受體/ampk抑制劑、creb結(jié)合蛋白和creb結(jié)合蛋白溴結(jié)構(gòu)域抑制劑；

19、所述c-jun激酶抑制劑為as601245，

20、所述dna甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑為vidaza，

21、所述單胺氧化酶抑制劑為反苯環(huán)丙胺，

22、所述ehmt2抑制劑為unc0224，

23、所述bmp受體/ampk抑制劑為dorsomorphin，所述creb結(jié)合蛋白和creb結(jié)合蛋白溴結(jié)構(gòu)域抑制劑為sgc-cbp30。

24、可選地，所述iii號培養(yǎng)基還包括以下組分：n2補充劑、b27補充劑、glutamaxtm、neaa、青霉素-鏈霉素、2-巰基乙醇、albumaxtm-ii、hrg、糖原激酶抑制劑、tgfβ抑制劑、細胞骨架重排相關(guān)的卷曲螺旋的蛋白激酶的選擇性抑制劑、組蛋白脫乙酰酶抑制劑、絲裂原活化蛋白激酶抑制劑、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、s-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑、單胺氧化酶抑制劑。

25、可選地，所述iv號培養(yǎng)基包括dmem高糖培養(yǎng)基，還包括以下組分：n2補充劑、b27補充劑、glutamaxtm、neaa、青霉素-鏈霉素、2-巰基乙醇、hrg、糖原激酶抑制劑、細胞骨架重排相關(guān)的卷曲螺旋的蛋白激酶的選擇性抑制劑、絲裂原活化蛋白激酶抑制劑、wnt抑制劑、b-raf抑制劑、組蛋白脫乙酰酶抑制劑。

26、可選地，所述組蛋白脫乙酰酶抑制劑為丙戊酸；所述wnt抑制劑為wnt-c59，所述b-raf抑制劑為plx4032。

27、可選地，所述絲裂原活化蛋白激酶抑制劑選自mirdametinib、mek162和ly2228820。

28、在一些實施方案中，所述絲裂原活化蛋白激酶抑制劑可以為mirdametinib和mek162的混合物、mirdametinib和ly2228820的混合物或mek162和ly2228820的混合物。

29、在一個具體的實施方案中，所述絲裂原活化蛋白激酶抑制劑還可以為mirdametinib、mek162或ly2228820。

30、可選地，所述絲裂原活化蛋白激酶抑制劑是摩爾比1：(0.25-0.45)的mirdametinib和ly2228820的混合物。

31、本技術(shù)中，絲裂原活化蛋白激酶抑制劑能夠阻斷或降低絲裂原活化蛋白激酶的活性，從而影響其參與的信號轉(zhuǎn)導過程，進而調(diào)控調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡等生命活動。通過試驗探究發(fā)現(xiàn)，本技術(shù)進一步采用mirdametinib和ly2228820的混合物作為絲裂原活化蛋白激酶抑制劑，制得的培養(yǎng)基能夠使人類體細胞的向多能干細胞的轉(zhuǎn)化效率更高，獲得的多能干細胞的特異性抗體oct4的表達量能夠達到90％以上，特異性抗體sox2的表達量能夠達到32％以上，特異性抗體nanog的表達量能夠達到94％以上。

32、在一些實施方案中，所述mirdametinib和ly2228820的摩爾比可以為1：(0.25-0.30)、(0.25-0.35)、(0.25-0.40)、(0.25-0.45)、(0.30-0.35)、(0.30-0.40)、(0.30-0.45)、(0.35-0.40)、(0.35-0.45)或(0.40-0.45)。

33、在一個具體的實施方案中，所述mirdametinib和ly2228820的摩爾比還可以為1：0.25、1：0.30、1：0.35、1：0.40或1：0.45。

34、可選地，所述i號培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為：37℃，5％?o2、5％?co2，誘導培養(yǎng)8-10天，間隔3-4天換一次培養(yǎng)液；

35、所述ii號培養(yǎng)基、iii號培養(yǎng)基、iv號培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件均為：37℃，5％?co2，間隔3-4天換一次培養(yǎng)液；ii號培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)10-12天，iii號培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)12-16天、iv號培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)12-14天。

36、可選地，所述體細胞為人供體組織分離的人類體細胞，包括但不限于人脂肪間充質(zhì)干細胞、人皮膚成纖維細胞。

37、第二方面，本技術(shù)提供一種將體細胞誘導為多能干細胞的方法獲得的多能干細胞。

38、本技術(shù)中，利用將上述方法獲得的多能干細胞能夠擴增超過20代，例如高達25、30、35、40、41、42代，能夠以與人間充質(zhì)干細胞相似的倍增時間增殖。

39、綜上所述，本技術(shù)具有以下有益效果：

40、1.本技術(shù)提供一種將體細胞誘導為多能干細胞的方法，該方法通過采用4種新型的培養(yǎng)基對人類體細胞進行誘導培養(yǎng)，能夠使其高效、穩(wěn)定地誘導重編為多能干細胞，該方法為細胞命運重編程領(lǐng)域提供了新思路與工具，從而能夠推動再生醫(yī)學、疾病模型構(gòu)建及藥物篩選等領(lǐng)域的發(fā)展。

41、2.本技術(shù)的培養(yǎng)基中使用的小分子為國產(chǎn)，因此多能干細胞的制備成本較低，能夠?qū)崿F(xiàn)大范圍推廣使用。

42、3.本技術(shù)進一步采用摩爾比1：(0.25-0.45)的mirdametinib和ly2228820的混合物作為絲裂原活化蛋白激酶抑制劑，能夠使獲得的多能干細胞的特異性抗體oct4、sox2和nanog的表達量更高。