本發(fā)明涉及免疫學、細胞生物學、分子生物學等多項領域。具體包括中性粒細胞的分離純化、利用細胞因子il-1β、ifn-γ和gm-csf聯(lián)合誘導中性粒細胞產(chǎn)生中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil?extracellular?traps，nets)。

背景技術：

1、中性粒細胞是人體免疫系統(tǒng)中最豐富的先天免疫效應細胞，它們通常是第一個被招募到炎癥部位的白細胞，能夠通過多種機制消除病原體，促進損傷修復。傳統(tǒng)上將中性粒細胞認為是炎性應答和急性免疫的效應細胞，其通過胞內吞噬作用發(fā)揮功能，并且使用裂解蛋白酶、活性氧(reactive?oxygen?radicals，ros)等殺滅病原微生物。近年研究還表明，除了吞噬作用之外，中性粒細胞還能通過釋放nets的方式黏附并清除病原微生物，并能有效限制病原體向其他組織部位播散。nets是一種細胞外結構，是由去濃縮的染色質和中性粒細胞來源的核蛋白、胞漿蛋白和顆粒蛋白組成的網(wǎng)狀結構，這些蛋白鑲嵌在dna骨架上大大增加了其局部濃度。

2、目前nets的誘導物則種類較多，除微生物之外，脂多糖(lipopolysaccharide，lps)、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(phorbol?12-myristate?13-acetate，pma)、葡萄糖氧化酶(glucose?oxidase,go)、腫瘤壞死因子α(tumor?necrosis?factor，tnf-α)等均能在一定程度上刺激中性粒細胞產(chǎn)生nets。

3、但是，現(xiàn)有的體外誘導nets的方法中，要么具有強烈致癌性和細胞毒性(例如pma)，要么需高濃度才具有良好誘導能力(例如lps)，或者藥物本身化學結構不穩(wěn)定(例如go)，同時，pma屬于外源性的誘導物質，不是細胞本身分泌，不能更好的模擬體內微環(huán)境。

4、因此，盡管pma等誘導物因其在體外誘導中性粒細胞產(chǎn)生nets的效果明顯而且常用作誘導劑，但仍存在諸多限制。因此尋求一種穩(wěn)定、有效的方法來誘導中性粒細胞產(chǎn)生nets，以及低毒性、低濃度的誘導物有助于更準確、高效的誘導產(chǎn)生nets。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種誘導中性粒細胞產(chǎn)生nets的方法，其步驟包括：

2、1.人外周血中性粒細胞的分離純化：

3、1)取新鮮抗凝全血，用等比無菌pbs稀釋全血。

4、2)在離心管中加入適量ficoll分離液(當稀釋后血液體積小于3ml時，加入3ml分離液；大于等于3ml，則加入等體積分離液。但二者的總體積不能超過離心管的三分之二，否則影響分離效果)，將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。

5、3)在室溫條件下，2000rpm，離心20min。

6、4)離心后將出現(xiàn)明顯的分層：最上層是稀釋的血漿層，中間是透明的分離液層，血漿與分離液之間的白膜層即為淋巴細胞層，離心管底部是紅細胞與粒細胞。

7、5)棄掉紅細胞和粒細胞沉淀之上的液體，用10mlpbs洗滌沉淀，2000rpm，離心5min。

8、6)棄上清，加6ml的紅細胞裂解液，裂解5min，隨后1800rpm，離心5min。

9、7)重復步驟6)一次。

10、8)加入10mlpbs，洗滌重懸細胞，即為中性粒細胞。

11、9)棄上清，加入一定量的rpmi?1640完全培養(yǎng)基重懸細胞備用。

12、10)運用流式細胞術檢測中性粒細胞的純度(以cd45、cd66b和cd16為指標)。

13、2.細胞因子聯(lián)合使用處理中性粒細胞：

14、1)按照1.提取細胞，根據(jù)實驗設計，200μl/孔中性粒細胞懸液分別加入10ng/mlifn-γ、1ng/ml?gm-csf和30ng/ml?il-1β。

15、2)37℃，5％co2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h。

16、3)培養(yǎng)結束后將細胞轉移至96孔圓底板中。

17、3.免疫熒光法檢測細胞因子聯(lián)合處理后中性粒細胞產(chǎn)生nets的情況：

18、1)根據(jù)2.處理中性粒細胞，1800rpm，離心5min，棄上清。

19、2)每孔加入200μl4％多聚甲醛室溫固定10min。

20、3)棄掉4％多聚甲醛，用冰pbs溶液洗滌三次。

21、4)每孔加入200μl?10％山羊血清室溫封閉1h。

22、5)每孔加入200μl一抗混懸液(nets特異性標志物cith3和mpo)。

23、6)4℃孵育過夜。

24、7)第二天棄掉一抗，用pbs溶液洗滌三次。

25、8)每孔加入200μl二抗混懸液，室溫避光孵育1h。

26、9)棄掉二抗，滴加dapi并進行封片。

27、10)于共聚焦顯微鏡下觀察其共定位的熒光成像。

28、4.酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)中性粒細胞產(chǎn)生nets的情況：

29、1)按照2.提取和培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)結束后將細胞轉移至96孔圓底板中，1000g，離心20min，收集細胞上清液。

30、2)每孔加入50μl的樣本和辣根過氧化物酶(hrp)標記的檢測抗體100μl，用封板膜封住反應孔，37℃恒溫箱溫育60min，靜置。

31、3)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350μl)，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次。

32、4)每孔加入底物a、b各50μl，37℃避光孵育15min。

33、5)每孔加入終止液50μl，15min內，450nm波長處測定各孔的od值。

技術特征：

1.一種誘導中性粒細胞產(chǎn)生nets的方法，包括步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，中性粒細胞的分離純化具體步驟：在室溫條件下，使用ficoll密度梯度離心法對人外周血樣本進行離心、裂解紅細胞等操作，得到純化的cd45+cd66b+cd16+中性粒細胞，純度達95％以上。

3.根據(jù)權利要求1所述的方法，nets的誘導方式具體步驟：聯(lián)合使用10ng/ml?ifn-γ+1ng/ml?gm-csf+30ng/ml?il-1β處理中性粒細胞12h，誘導中性粒細胞產(chǎn)生nets。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，nets定量分析與鑒定的具體方法：通過免疫熒光法檢測nets的標志物cith3和mpo，運用imagej分析其平均熒光強度；通過elisa檢測中性粒細胞上清液中mpo-dna和cith3定量nets。

技術總結
本發(fā)明提供了一種誘導中性粒細胞產(chǎn)生NETs的方法，涉及免疫學、分子生物學等技術領域。所述增加中性粒細胞產(chǎn)生NETs的方法包括：1)中性粒細胞的分離純化；2)中性粒細胞的誘導方式；3)NETs的鑒別與定量。本發(fā)明得到了高純度的中性粒細胞，而且成功增加了NETs的含量，對中性粒細胞的生物學研究及其臨床應用等方面都具有重要的臨床意義。

技術研發(fā)人員：劉思益,王婷婷,于超
受保護的技術使用者：重慶醫(yī)科大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2025/1/2