本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，涉及一種gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株感染性克隆構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、日本腦炎(je)是一種由日本腦炎病毒(jev)引起的重要人畜共患病，是世界上最常發(fā)生的病毒性腦炎，在中國、印度、印度尼西亞、孟加拉國和巴基斯坦等國家廣泛傳播。全世界有超過24個國家存在jev的流行，每年估計有67,900例je報告，導(dǎo)致10,000人死亡和約15,000例神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。je是自然疫源性疫病，許多動物可感染本病毒，但多為隱性感染，特別是牛和羊。病畜以及隱性感染期間病毒血癥階段均可成為傳染源，其中豬是最主要的傳染源。je主要通過蚊蟲的叮咬經(jīng)皮膚傳播。蚊子不僅是傳染媒介，也是病毒的貯存宿主。

2、jev是一種單鏈rna病毒，屬于黃病毒科黃病毒屬，其基因組長度約為11kb?；趀基因或完整病毒基因組的核苷酸序列，將jev分為5種基因型(gi、gⅱ、gⅲ、gⅳ和gv)。je研究表明，jev起源于印度尼西亞-馬來西亞地區(qū)，屬于同一個祖先，并在那里分化為5個基因型，其中2種比較古老、發(fā)散的基因型(giv和gv)目前仍在該區(qū)域傳播，3種近幾十年新進化的基因型(gi、gii和giii)已經(jīng)擴散到其他區(qū)域。giii于1935年首次在日本被發(fā)現(xiàn)，直到20世紀末，它一直是整個亞洲最主要的基因型。之前的監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，1994年日本的giii被gi取代，此后，gi成為許多亞洲國家的主要流行jev基因型。最近的一些研究報告稱，gi在其jev擴增宿主中的復(fù)制效率高于giii，這可能是gi逐漸取代giii成為新的優(yōu)勢基因型的原因。

3、接種je疫苗是預(yù)防jev感染最有效的控制措施。目前，世界不同地區(qū)有四種不同類型的je疫苗可供使用：小鼠腦源性中山滅活疫苗、細胞培養(yǎng)源sa14-14-2減毒活疫苗(sa14-14-2疫苗)、培養(yǎng)源滅活疫苗和基因工程減毒嵌合活疫苗，所有疫苗均來自giii株。sa14-14-2疫苗是許多亞洲國家廣泛使用的疫苗；然而，giii疫苗對g1感染的保護效力并不樂觀。在中國和印度，仍能從接種sa14-14-2疫苗的患者體內(nèi)分離出gi型jev病毒。可見，目前giii型的jev疫苗可能難以對gi型提供完全的保護，因此，研制新型的gi型的jev疫苗迫在眉睫。

4、中國期刊論文《流行性日本腦炎病毒gi型毒株sd12在c57bl/6小鼠體內(nèi)的動態(tài)分布研究》中應(yīng)用qrt-pcr方法檢測該毒株在小鼠體內(nèi)各組織的動態(tài)分布情況，研究表明基因i型流行性日本腦炎病毒感染血腦屏障受損的c57bl/6小鼠后能迅速入侵各組織臟器，主要浸染肝臟、肺臟、腎臟、盲腸和大腦，擁有完整血腦屏障的小鼠對病毒具有一定抵抗能力，病毒在各組織中的含量相對比較低。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有的giii型的jev疫苗難以對gi型jev提供完全的保護，且目前實際應(yīng)用中缺少giii型的jev疫苗的技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120及其感染性克隆的構(gòu)建方法，通過gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120進行反向遺傳操作獲得重組毒株rsd12-f120，本發(fā)明所述弱毒疫苗株sd12-f120對gi型日本腦炎病毒具有良好的免疫原性和保護效果，為預(yù)防gi型日本腦炎病毒病疫苗的開發(fā)和疫苗株的篩選提供了新的選擇。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明目的之一在于提供一種gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株感染性克隆，該弱毒疫苗株命名為sd12-f120，其cdna序列如seq?id?no.1所示。

4、本發(fā)明目的之二在于提供一種上述所述gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120感染性克隆的構(gòu)建方法，其包括如下步驟：

5、(1)將gi型日本腦炎病毒sd12株的cdna序列分段擴增獲得的第1-2350位核酸片段、第2351-4470位核酸片段、第4471-7640位核酸片段以及第7641-10965核酸片段分別克隆至載體，對第1-2350位核酸片段中e基因進行pcr定點突變，將突變后的核酸片段與第2351-4470位核酸片段、第4471-7640位核酸片段以及第7641-10965核酸片段使用特異性引物進行擴增，通過融合pcr獲得含有轉(zhuǎn)錄啟動子的弱毒疫苗株的全長cdna；

6、(2)將獲得的全長cdna經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、細胞轉(zhuǎn)染，即獲得日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120的感染性克隆毒株rsd12-f120。

7、作為優(yōu)選，所述步驟(1)中針對e基因的pcr定點突變的位點為e基因的第138位和第176位氨基酸位點，其中第138位氨基酸由谷氨酸突變?yōu)榫彼幔?76位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

8、作為優(yōu)選，突變后的e基因的核苷酸序列如seq?id?no.16所示。

9、作為優(yōu)選，所述e基因的第138位氨基酸位點突變的正向引物e-e138r-f的序列如seq?id?no.2所示，反向引物e-e138r-r的序列如seq?id?no.3所示；所述e基因的第176位氨基酸位點突變的正向引物e-i176t-f的序列如seq?id?no.4所示，反向引物e-i176t-r的序列如seq?id?no.5所示。

10、作為優(yōu)選，所述突變后的第1-2350位核酸片段的正向特異性引物如seq?id?no.6所示，反向引物的序列如seq?id?no.7所示；所述第2351-4470位核酸片段的正向特異性引物如seq?id?no.8所示，反向引物的序列如seq?id?no.9所示；所述第4471-7640位核酸片段的正向特異性引物如seq?id?no.10所示，反向引物的序列如seq?id?no.11所示；所述第7641-10965核酸片段的正向特異性引物如seq?id?no.12所示，反向引物的序列如seq?idno.13所示。

11、優(yōu)選的，所述步驟1)中的轉(zhuǎn)錄啟動子為t7啟動子。

12、本發(fā)明還對所述的gi型日本腦炎弱毒疫苗株sd12-f120進行驗證，包括繪制生長曲線，觀察蝕斑形態(tài)以及對小鼠的致病性實驗，同時與親本毒株sd12進行對比。實驗結(jié)果顯示，通過腹腔內(nèi)或顱內(nèi)途徑接種100-105pfu劑量的sd12-f120的小鼠，即使在最高劑量為105pfu時，也沒有出現(xiàn)jev感染的臨床跡象，而通過腹腔內(nèi)途徑接種sd12的小鼠從101pfu的劑量開始出現(xiàn)了jev感染的臨床癥狀，通過腦內(nèi)途徑接種sd12的小鼠從1pfu的劑量開始產(chǎn)生jev感染的臨床體征。這表明，sd12-f120毒株在小鼠中失去了神經(jīng)侵襲性和神經(jīng)毒性，并成功獲得了gi型弱毒株sd12-f120。

13、本發(fā)明目的之三在于請求保護所述jev?gi型弱毒疫苗株sd12-f120在預(yù)防哺乳動物jev感染的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述的哺乳動物為公豬或母豬。本發(fā)明在小鼠模型和公豬模型中對jev?gi型弱毒疫苗株sd12-f120進行預(yù)防jev感染的應(yīng)用。實施例2實驗結(jié)果顯示，sd12-f120免疫后能為gi?sd12和giii?nj28感染的小鼠提供完全保護，而免疫對照組sa14-14-2低劑量免疫后無法為gi?sd12感染的小鼠提供完全保護，同時日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120具有良好的免疫原性，可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對gi型jev?sd12具有保護作用的中和抗體。實施例3的實驗結(jié)果顯示，免疫組所有小豬各種臨床癥狀表現(xiàn)正常。攻毒對照組所有小豬都出現(xiàn)了乙腦感染后的癥狀，具體有精神亢奮，體溫升高等癥狀，其中三只公豬出現(xiàn)不同程度的睪丸腫脹，也有表現(xiàn)出食欲減退等。病理切片結(jié)果顯示，攻毒對照組豬睪丸生精小管正常結(jié)構(gòu)已經(jīng)明顯被破壞，有大量炎癥細胞浸潤，以淋巴細胞為主，伴有漿細胞、中性粒細胞和單核細胞，間質(zhì)纖維組織明顯增生。dmem對照組和免疫后攻毒組的豬睪丸的生精小管結(jié)構(gòu)正常，這表明jev弱毒株sd12-p120能有效保護公豬免于發(fā)生睪丸炎，同時sd12-f120對公豬具有良好的免疫原性，免疫后小豬的中和抗體水平均超過保護水平。

14、本發(fā)明gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：本發(fā)明中所述gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120及其感染性克隆，通過gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120進行反向遺傳操作獲得重組毒株rsd12-f120，該弱毒疫苗株在小鼠模型上對gi型和giii型日本腦炎病毒均具有保護效果并具有良好的免疫效果；同時，所述的gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120株在豬體內(nèi)具有良好的安全性和免疫原性。本發(fā)明所述的gi型日本腦炎病毒弱毒疫苗株sd12-f120株為gi型jev為基因i型乙腦疫苗的開發(fā)和適用提供了候選株。