本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵，尤其涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)d-泛醇的方法。

背景技術(shù)：

1、泛醇又稱維生素原b5，化學(xué)分子式c9h19no4，相對(duì)分子量205.25，其溶液的黏度較大在40℃時(shí)的粘度就在10000厘泊以上。泛醇可分為混旋體(dl-型)、右旋體(d-型)和左旋體(l-型)3種形式，其中，只有d-泛醇具有生物活性。d-泛醇是維生素b5(泛酸)的前體，也是d-泛酸的同效物，廣泛的應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、液體制劑、以及化妝品行業(yè)中。目前，尋找一種高效合成d-泛醇的方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2、d-泛醇在微生物、植物、動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在，由d-泛解酸內(nèi)酯和3-氨基丙醇在泛酸內(nèi)酯水解酶的作用下生成，其中生物體內(nèi)編碼泛酸內(nèi)酯水解酶的基因多為panc基因。d-泛醇再經(jīng)一系列的生物化學(xué)反應(yīng)可生成d-泛酸(維生素b5)，然后作為合成?；d體蛋白(acp)和輔酶a(coa)的重要前體進(jìn)入到tca循環(huán)中。

3、現(xiàn)有的d-泛醇的制備方法主要是化學(xué)合成法和微生物酶法?；瘜W(xué)合成法大多是以d-泛解酸內(nèi)酯和3-氨基丙醇為原料，在有溶劑或無(wú)溶劑的條件下通過(guò)?；磻?yīng)來(lái)合成d-泛醇。微生物酶法大多是通過(guò)微生物過(guò)表達(dá)相應(yīng)的酶，經(jīng)分離純化后用于d-泛醇的生產(chǎn)。

4、現(xiàn)有技術(shù)中，申請(qǐng)公布號(hào)為cn101851171a的中國(guó)專利公開(kāi)了一種無(wú)溶劑制備d-泛醇的方法，該專利將d-泛解酸內(nèi)酯和3-氨基丙醇在無(wú)溶劑條件下反應(yīng)，得到了高純度的d-泛醇，雖然此方法省去了分離溶劑的步驟并且得到的d-泛醇的光學(xué)純度較高，但這種方法對(duì)于原料的要求較高，且其在無(wú)溶劑條件下所得的d-泛醇的黏度較大造成原料直接反應(yīng)會(huì)逐漸變緩，導(dǎo)致產(chǎn)品的收率較低，且其較高的黏度也不利于后續(xù)的操作和利用，得到的產(chǎn)品的實(shí)際利用率較低。

5、通過(guò)微生物酶法來(lái)制備d-泛醇在專利cn1173042c中有所提及，其利用一株高產(chǎn)d-泛解酸內(nèi)酯水解酶的串珠鐮孢霉菌(fusarium?moniliforme)進(jìn)行發(fā)酵，得到d-泛解酸內(nèi)酯水解酶，用該菌株所生產(chǎn)的酶去水解底物d-泛解酸內(nèi)酯和3-氨基丙醇得到目的產(chǎn)物d-泛醇。此方法克服了化學(xué)法生產(chǎn)d-泛醇成本高、有污染、有毒性和光學(xué)純度不高的缺點(diǎn)。但此方法也有著許多缺點(diǎn)，其一，用微生物所產(chǎn)的酶去催化d-泛解酸內(nèi)酯和3-氨基丙醇進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)泛醇需要將酶進(jìn)行一定的分離純化，這大大提高了操作成本和生產(chǎn)效率；其二，酶的穩(wěn)定性較差，只有在最適條件下才能最好的發(fā)揮酶的催化活力，且酶易失活，不利于工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述高效合成d-泛醇的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)d-泛醇的方法。

2、本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：

3、本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)d-泛醇的方法，包括以下步驟：

4、步驟s1：在底盤菌中過(guò)表達(dá)panc基因，得到dfc01菌株；

5、步驟s2：將所述dfc01菌株接種培養(yǎng)，得到種子液；

6、步驟s3：將所述種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)；

7、所述發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行以下條件的控制：

8、在12～24小時(shí)期間，流加一類補(bǔ)料培養(yǎng)基，并通過(guò)控制補(bǔ)料速度使發(fā)酵液中葡萄糖的濃度處于0.5～2g/l范圍；

9、在24小時(shí)至發(fā)酵結(jié)束期間，流加二類補(bǔ)料培養(yǎng)基，并通過(guò)控制攪拌速度使發(fā)酵液中溶氧濃度處于28％～40％范圍。

10、針對(duì)現(xiàn)有工藝存在的d-泛醇光學(xué)純度不高，且難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用的問(wèn)題，本技術(shù)通過(guò)對(duì)改造菌株dfc01菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)d-泛醇，并基于dfc01菌株，設(shè)計(jì)了適合其大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)d-泛醇的多階段控制發(fā)酵工藝，通過(guò)發(fā)酵中期12～24小時(shí)期間，控制發(fā)酵液中葡萄糖的濃度處于0.5～2g/l范圍，以及，通過(guò)發(fā)酵后期24小時(shí)至發(fā)酵結(jié)束期間，控制發(fā)酵液中溶氧濃度處于28％～40％范圍，使得降低發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物積累的同時(shí)，提高d-泛醇產(chǎn)量以及糖酸轉(zhuǎn)化率。

11、作為上述方法的優(yōu)選，在12～24小時(shí)期間，流加一類補(bǔ)料培養(yǎng)基，并通過(guò)控制補(bǔ)料速度使發(fā)酵液中葡萄糖的濃度處于0.8～1.5g/l范圍。

12、作為上述方法的優(yōu)選，在24小時(shí)至發(fā)酵結(jié)束期間，流加二類補(bǔ)料培養(yǎng)基，并通過(guò)控制攪拌速度使發(fā)酵液中溶氧濃度處于32％～35％范圍。

13、作為上述方法的優(yōu)選，所述控制攪拌速度使轉(zhuǎn)速為400～700r/min。

14、作為上述方法的優(yōu)選，一類補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：葡萄糖300g/l，硫酸鎂8g/l，磷酸二氫鉀14g/l，硫酸銨10g/l，維生素b12?0.002g/l，維生素b1?0.005g/l，異亮氨酸0.08g/l，鹽溶液2ml/l，iptg?1mol/l。

15、作為上述方法的優(yōu)選，二類補(bǔ)料培養(yǎng)基組成為：葡萄糖200g/l，硫酸鎂6g/l，磷酸二氫鉀7g/l，3-氨基丙醇15g/l，硫酸銨10g/l，維生素b12?0.002g/l，維生素b1?0.005g/l，異亮氨酸0.08g/l，鹽溶液2ml/l，表面活性劑10ml/l。

16、作為上述方法的優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為28.0～32.0℃，所述發(fā)酵培養(yǎng)的ph為6.5～7.0。

17、作為上述方法的優(yōu)選，步驟s1中，panc基因來(lái)源于大腸桿菌escherichia?coliw3110、枯草芽孢桿菌bacillus?subtilis、地衣芽孢桿菌bacillus?licheniformis、谷氨酸棒狀桿菌corynebacterium?glutamicum、串珠鐮孢霉菌fusarium?moniliforme。

18、作為上述方法的優(yōu)選，步驟s2中，種子液的培養(yǎng)時(shí)間為10～15h。

19、作為上述方法的優(yōu)選，步驟s3中，種子液接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10％～15％。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下技術(shù)效果：

21、(1)本發(fā)明通過(guò)對(duì)改造菌株dfc01菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)d-泛醇，并基于dfc01菌株，設(shè)計(jì)了適合其大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)d-泛醇的多階段控制發(fā)酵工藝，通過(guò)發(fā)酵中期12～24小時(shí)期間，控制發(fā)酵液中葡萄糖的濃度處于0.5～2g/l范圍，以及，通過(guò)發(fā)酵后期24小時(shí)至發(fā)酵結(jié)束期間，控制發(fā)酵液中溶氧濃度處于28％～40％范圍，使得降低發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物積累的同時(shí)，提高d-泛醇產(chǎn)量以及糖酸轉(zhuǎn)化率。

22、(2)本發(fā)明提供的方法，針對(duì)dfc01菌株，給出了最優(yōu)的生產(chǎn)的d-泛醇的發(fā)酵條件，并采用了雙補(bǔ)料方法，在接種12h～24h期間進(jìn)行一類補(bǔ)料，在接種24h～發(fā)酵結(jié)束期間進(jìn)行二類補(bǔ)料，加入3-氨基丙醇和表面活性劑，使得菌株充分生長(zhǎng)的同時(shí)，兼顧過(guò)表達(dá)泛酸合成酶，有效的避免了只長(zhǎng)菌不合成代謝產(chǎn)物的情況出現(xiàn)，提高了發(fā)酵罐整體產(chǎn)d-泛醇的能力，最終使得高效合成d-泛醇。本發(fā)明方法可以為其他工程菌發(fā)酵高效生產(chǎn)d-泛醇提供指導(dǎo)。

23、(3)本發(fā)明提供的方法基于微生物發(fā)酵進(jìn)行，具有綠色無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，以本發(fā)明提供的方法d-泛醇產(chǎn)量以及糖酸轉(zhuǎn)化率高，且與現(xiàn)有的d-泛醇生產(chǎn)工藝相比光學(xué)純度較高，可達(dá)99.8％，另外，本發(fā)明方法實(shí)施簡(jiǎn)便，適合工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)d-泛醇。