本發(fā)明涉及食品檢測(cè)，涉及一種特異組合物及試劑盒、檢測(cè)方法，具體涉及一種快速檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌的特異組合物及試劑盒、檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、人們通常所說(shuō)的蠟樣芽孢桿菌是一種狹義的、革蘭氏陽(yáng)性的條件致病菌。蠟樣芽孢桿菌感染常見(jiàn)的臨床表現(xiàn)為嘔吐型或腹瀉型的消化系統(tǒng)中毒，但其也可能引起更為嚴(yán)重的疾病，如腦膜炎、人工瓣膜心內(nèi)膜炎和主動(dòng)脈膿腫等，甚至致人死亡。蘇云金芽胞桿菌因其良好的殺蟲(chóng)效果而被當(dāng)做生物殺蟲(chóng)劑廣泛應(yīng)用。近期的研究表明，蘇云金芽孢桿菌對(duì)多種害蟲(chóng)的防治效果均較為理想，尤其是線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、螨類(lèi)等。對(duì)于蕈狀芽孢桿菌的研究較少，主要用于土壤修復(fù)，增強(qiáng)小鼠免疫力。三種目標(biāo)菌基因組同源分析結(jié)果表明它們?cè)赿na同源性極高，生化特性也較為接近，但蠟樣芽孢桿菌(bc)被認(rèn)為是一種致病菌，蘇云金芽孢桿菌(bt)作為有益的生物殺蟲(chóng)劑而被廣泛應(yīng)用。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法區(qū)分這三種菌，尤其是蠟樣芽孢桿菌(bc)十分有必要。

2、目前，國(guó)標(biāo)法gb?4789.14-2014主要采用生化培養(yǎng)的方法進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌的鑒定，雖然這種方法能夠直觀明確的觀察到菌體的各種特征，技術(shù)要求不高，成本低，但這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要進(jìn)行菌株的分離、培養(yǎng)和鑒定，過(guò)程可能需要幾天到幾周，并且靈敏度低，難以檢測(cè)低濃度的蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌，主觀性強(qiáng)，菌落形態(tài)鑒定依賴(lài)操作者的經(jīng)驗(yàn)，存在誤判風(fēng)險(xiǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種特異組合物及試劑盒、檢測(cè)方法，具體為能夠快速檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌的特異組合物及試劑盒、檢測(cè)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)鑒定蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、主觀判定性強(qiáng)、過(guò)于依賴(lài)操作者的經(jīng)驗(yàn)存在誤判風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題。

2、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種特異組合物，所述特異組合物能夠用于檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌；所述特異組合物包括多個(gè)引物和探針；

4、當(dāng)目標(biāo)菌株為蠟樣芽孢桿菌時(shí)，

5、前向引物gyrb-f的序列為：gtaaattagctgattgctcttcgaaa；

6、后向引物gyrb-r的序列為：cgatcgcgtccttgttttg；

7、探針gyrb-p的序列為：hex-ttacatcgtagagggtgactc-tamrar；

8、當(dāng)目標(biāo)菌株為蘇云金芽胞桿菌時(shí)，

9、前向引物cry-f的序列為：gattcatgcggcagataaacgt；

10、后向引物cry-r的序列為：ttcttcaaaaatagccgcattg；

11、探針cry-p的序列為：fam-cttatctgcctgagctgtctgtgattccg-tamrar；

12、當(dāng)目標(biāo)菌株為蕈狀芽胞桿菌時(shí)，

13、前向引物n451-2-f的序列為：aggcgtcatgaaaccaattcc；

14、后向引物n451-2-r的序列為：ccaggagcagcacaactatcag；

15、探針n451-2-p的序列為：rox-ttcaaagcgttgatattgatacg-eclipse。

16、優(yōu)選地，所述特異組合物能夠單獨(dú)用于一種目標(biāo)菌株的檢測(cè)；或者同時(shí)用于檢測(cè)1～3種目標(biāo)菌株的檢測(cè)。

17、本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括上述特異組合物。具體為：包括上述所有特異組合物；或者包括至少一種上述目標(biāo)菌株所對(duì)應(yīng)的引物和探針。

18、優(yōu)選地，在試劑盒的擴(kuò)增體系中，前向引物的濃度為0.04-0.2μmol/l，后向引物濃度為0.04-0.2μmol/l，探針的濃度為0.04-0.2μmol/l；目標(biāo)菌dna模板的濃度為0.00004-4ng/μl；所述特異組合物與目標(biāo)菌dna模板、以及熒光定量擴(kuò)增預(yù)混液和雙蒸水配置成25μl的反應(yīng)體系。此處，引物和探針的濃度是指單個(gè)引物和單個(gè)探針在整個(gè)擴(kuò)增體系中的濃度，實(shí)際使用時(shí)，試劑盒中的擴(kuò)增體系可進(jìn)行提前配制以便于后續(xù)檢測(cè)使用，配制后使各個(gè)引物和探針的濃度滿(mǎn)足上述范圍即可。

19、本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌的方法，具體包括如下步驟：

20、步驟1：從待測(cè)樣品中提取dna模板；

21、步驟2：將步驟1提取出的dna模板放入上述試劑盒中進(jìn)行擴(kuò)增處理；

22、步驟3：實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)系統(tǒng)記錄步驟2得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度變化，獲取熒光曲線，確定設(shè)定的時(shí)間內(nèi)達(dá)到設(shè)定閾值所需的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)ct值，判斷待測(cè)樣品中是否含有蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌。

23、優(yōu)選地，在試劑盒的擴(kuò)增體系中，前向引物的濃度為0.04-0.2μmol/l，后向引物濃度為0.04-0.2μmol/l，探針的濃度為0.04-0.2μmol/l；目標(biāo)菌dna模板的濃度為0.00004-4ng/μl；所述特異組合物與目標(biāo)菌dna模板、以及熒光定量擴(kuò)增預(yù)混液和雙蒸水配置成25μl的反應(yīng)體系。此處，前向引物和后向引物的濃度為單個(gè)前向引物或者單個(gè)后向引物在擴(kuò)增體系中的濃度，探針的濃度為單個(gè)單針在擴(kuò)增體系中的濃度。

24、優(yōu)選地，在步驟2中，所述擴(kuò)增處理的反應(yīng)條件如下：

25、94.0℃保持30s；94.0℃保持5s，60.0℃保持30s；這一處理順序被認(rèn)為是1次循環(huán)，以此循環(huán)40次。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

27、本發(fā)明設(shè)計(jì)并獲得了特異引物組，通過(guò)所述引物組能夠顯著提高對(duì)蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌鑒別的準(zhǔn)確率，將檢測(cè)時(shí)間由現(xiàn)有技術(shù)所需的3-10d，縮短至6h。本發(fā)明所述檢測(cè)方法能夠快速鑒別出食品中蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌，從而更好的從同源性極高的三種菌中區(qū)分食源性致病菌蠟樣芽孢桿菌，為監(jiān)管部門(mén)檢測(cè)食源性致病菌提供技術(shù)支持。

技術(shù)特征：

1.一種特異組合物，其特征在于，所述特異組合物能夠用于檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌；所述特異組合物包括多個(gè)引物和多個(gè)探針；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述特異組合物，其特征在于，所述特異組合物能夠單獨(dú)用于一種目標(biāo)菌株的檢測(cè)；或者同時(shí)用于檢測(cè)1～3種目標(biāo)菌株的檢測(cè)。

3.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述特異組合物。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，在試劑盒的擴(kuò)增體系中，前向引物的濃度為0.04-0.2μmol/l，后向引物濃度為0.04-0.2μmol/l，探針的濃度為0.04-0.2μmol/l；目標(biāo)菌dna模板的濃度為0.00004-4ng/μl；所述特異組合物與目標(biāo)菌dna模板、以及熒光定量擴(kuò)增預(yù)混液和雙蒸水配置成25μl的反應(yīng)體系。

5.一種快速檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌的方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，在試劑盒的擴(kuò)增體系中，前向引物的濃度為0.04-0.2μmol/l，后向引物濃度為0.04-0.2μmol/l，探針的濃度為0.04-0.2μmol/l；目標(biāo)菌dna模板的濃度為0.00004-4ng/μl；所述特異組合物與目標(biāo)菌dna模板、以及熒光定量擴(kuò)增預(yù)混液和雙蒸水配置成25μl的反應(yīng)體系。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，在步驟2中，所述擴(kuò)增處理的反應(yīng)條件如下：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種特異組合物及試劑盒、檢測(cè)方法，本發(fā)明設(shè)計(jì)并獲得了特異引物組，通過(guò)所述引物組能夠顯著提高對(duì)蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌鑒別的準(zhǔn)確率，將檢測(cè)時(shí)間由現(xiàn)有技術(shù)所需的3?10d，縮短至6h。本發(fā)明所述檢測(cè)方法能夠快速鑒別出食品中蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌，從而更好的從同源性極高的三種菌中區(qū)分食源性致病菌蠟樣芽孢桿菌，為監(jiān)管部門(mén)檢測(cè)食源性致病菌提供技術(shù)支持。

技術(shù)研發(fā)人員：袁磊,劉明明,秦愛(ài),王娟,余秋地,張明娟,周朝旭,肖昭競(jìng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26