本發(fā)明涉及了一種功能蛋白分子的構(gòu)建及結(jié)合金屬離子交聯(lián)、或底物酶促反應(yīng)交聯(lián)的應(yīng)用方法，尤其是涉及了一種利用表皮蛋白結(jié)合金屬離子交聯(lián)、或底物酶促反應(yīng)交聯(lián)，并利用這種體內(nèi)外聯(lián)合作用制造高性能復(fù)合絲的方法。

背景技術(shù)：

1、蠶絲纖維是人們最早利用、產(chǎn)量最大的天然絲材料，由于它具有吸濕性強(qiáng)、手感舒適及透氣性好等優(yōu)點(diǎn)，所以被譽(yù)為“纖維皇后”。傳統(tǒng)的蠶絲纖維主要應(yīng)用于紡織業(yè)，隨著加工技術(shù)的改進(jìn)和交叉學(xué)科的發(fā)展，目前已開發(fā)出許多功能性的絲纖維，拓展了應(yīng)用領(lǐng)域，如應(yīng)用于傷口愈合、生物傳感器、能量收集等。

2、但蠶絲的抗拉強(qiáng)度低于凱夫拉和尼龍，此外蠶絲作為紡織材料存在易褪色、易皺等缺陷，這些問(wèn)題限制了蠶絲纖維的進(jìn)一步應(yīng)用與推廣。為了解決蠶絲纖維存在機(jī)械性能不足等問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外研究人員嘗試使用不同的方法來(lái)改良蠶絲品質(zhì)。主要方法包括物理化學(xué)法、添食法和基因操作法。

3、物理化學(xué)處理方式主要有熱處理、調(diào)整紡絲速度以及輻射處理等；添食法即將石墨烯、納米顆?；蚪饘僭氐炔牧咸砑釉谏Ｈ~或人工飼料中喂養(yǎng)家蠶或者直接注射到家蠶體內(nèi)，以此改良蠶絲纖維的性能；基因操作法是采用基因操控技術(shù)將外源基因，主要是蜘蛛絲基因?qū)爰倚Q，對(duì)家蠶進(jìn)行遺傳改造，培育新品種，獲得具有高性能的蠶絲材料。上述幾種改良方法，或者是依靠對(duì)蠶絲蛋白分子本身的處理改善蠶絲性能，或者是通過(guò)導(dǎo)入外源蛋白分子改善蠶絲性能，存在操作繁瑣、效果不佳的諸多問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決背景技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于開發(fā)表皮蛋白與蠶絲蛋白間接或直接結(jié)合，在蠶體內(nèi)預(yù)先設(shè)置功能分子，并通過(guò)功能分子與金屬離子交聯(lián)、或與底物交聯(lián)的方法，建立體內(nèi)外聯(lián)合作用以開發(fā)新型高性能復(fù)合絲的方法。

2、本發(fā)明大幅度提升了蠶絲經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開創(chuàng)蠶桑生產(chǎn)新局面，具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景。

3、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案的步驟如下：

4、所述方法是先利用基因操作將外源基因?qū)爰倚Q基因組內(nèi)并培育成新轉(zhuǎn)基因家蠶品種，然后再在蠶體外針對(duì)家蠶分泌出的蠶絲物質(zhì)進(jìn)行選擇和理化處理，進(jìn)而改善蠶絲性能，生產(chǎn)性能優(yōu)異的復(fù)合絲。

5、所述方法具體是先利用轉(zhuǎn)基因或者基因編輯的基因操作技術(shù)將外源基因?qū)爰倚Q基因組或精準(zhǔn)同源整合到家蠶基因組特定位點(diǎn)，再培育獲得穩(wěn)定遺傳的新型家蠶品種，合成分泌復(fù)合絲蛋白，然后利用離子交聯(lián)方法或者底物酶促反應(yīng)方法對(duì)復(fù)合絲蛋白進(jìn)行理化處理以改變復(fù)合絲蛋白的性質(zhì)。

6、所述基因編輯包含talen或crispr。

7、所述外源基因是指家蠶表皮蛋白基因，具體為rr-1、rr-2、rr-3、cpg、cph或glycine-rich中的一種基因：

8、所述的家蠶表皮蛋白基因rr-1的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.1和seqid?no.2；

9、所述的家蠶表皮蛋白基因rr-2的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.3和seqid?no.4；

10、所述的家蠶表皮蛋白基因rr-3的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.5和seqid?no.6；

11、所述的家蠶表皮蛋白基因cpg的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.7和seqid?no.8；

12、所述的家蠶表皮蛋白基因cph的基因序列和蛋白序列分別為seq?id?no.9和seqid?no.10；

13、所述的家蠶表皮蛋白基因glycine-rich的基因序列和蛋白序列分別為seq?idno.11和seq?id?no.12。

14、所述基因操作是將家蠶表皮蛋白基因?qū)爰倚Q基因組中，或精準(zhǔn)同源整合到家蠶的絲素重鏈基因、絲素輕鏈基因、絲素p25基因、絲膠1基因中。

15、所述理化處理是將復(fù)合絲蛋白在體外進(jìn)一步處理，具體是復(fù)合絲蛋白在體外或在繅制過(guò)程中添加鋅金屬離子，使復(fù)合絲蛋白分子與鋅離子發(fā)生交聯(lián)，進(jìn)而改善復(fù)合絲性能，獲得提高了力學(xué)機(jī)械性能的復(fù)合絲。

16、所述理化處理是將復(fù)合絲蛋白在體外進(jìn)一步處理，具體是復(fù)合絲蛋白在體外或在繅制過(guò)程中添加底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，使復(fù)合絲蛋白發(fā)生交聯(lián)以改善復(fù)合絲性能，所述底物為n-乙酰多巴胺(nada)或n-β丙酰多巴胺(nbad)，所述酶為漆酶2。

17、本發(fā)明是利用轉(zhuǎn)基因或基因編輯技術(shù)，結(jié)合體外理化處理，使家蠶生產(chǎn)制備力學(xué)機(jī)械性能優(yōu)良的復(fù)合絲的應(yīng)用。

18、更具體地，方法是先通過(guò)基因工程方法生物合成目的家蠶表皮蛋白基因序列作為外源基因，然后采用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建外源基因載體，通過(guò)顯微注射將外源基因載體導(dǎo)入家蠶卵內(nèi)并整合到家蠶基因組內(nèi)，或精準(zhǔn)同源整合到家蠶的特定基因中，對(duì)家蠶進(jìn)行多代培育，通過(guò)熒光顯微鏡篩選獲得g1代陽(yáng)性個(gè)體，g1代陽(yáng)性個(gè)體分別與野生型交配或陽(yáng)性個(gè)體自交得到g2代，g3代后均篩選陽(yáng)性個(gè)體并采用陽(yáng)性個(gè)體自交留種，到g8代育成穩(wěn)定遺傳的品種；

19、然后利用g8代的家蠶進(jìn)行生產(chǎn)分泌蠶絲，此蠶絲為復(fù)合絲蛋白，在蠶絲添加鋅離子使蠶絲蛋白分子與鋅離子發(fā)生交聯(lián)，或者與底物n-乙酰多巴胺(nada)或n-β丙酰多巴胺(nbad)混合，最后添加漆酶2催化，進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，從而改善復(fù)合絲的性能。

20、所述的目的基因序列為所述的家蠶表皮蛋白對(duì)應(yīng)的基因堿基序列，最終獲得能夠穩(wěn)定遺傳的復(fù)合絲性能優(yōu)異的新型家蠶品種。

21、所述的陽(yáng)性個(gè)體是指顯現(xiàn)熒光并且正確表達(dá)外源基因的個(gè)體。

22、所述的野生型是指未導(dǎo)入外源基因載體的家蠶卵培育成的個(gè)體。

23、所述的組蛋白分子對(duì)應(yīng)的外源基因載體是采用以piggybac為骨架的轉(zhuǎn)基因載體或者應(yīng)用于talen或crispr基因編輯的同源重組載體；

24、所述的外源基因載體包括外源基因表達(dá)框和熒光篩選標(biāo)記基因表達(dá)框；

25、外源基因表達(dá)框包括外源基因和表達(dá)框的啟動(dòng)子，外源基因?yàn)闄?quán)利要求2所述的家蠶表皮蛋白基因rr-1、rr-2、rr-3、cpg、cph或glycine-rich的蛋白序列對(duì)應(yīng)的基因堿基序列，外源基因表達(dá)框的啟動(dòng)子采用絲素蛋白重鏈、絲素蛋白輕鏈、絲素蛋白p25或者絲膠蛋白等基因的啟動(dòng)子；

26、熒光篩選標(biāo)記基因表達(dá)框包括熒光篩選標(biāo)記基因和表達(dá)框的啟動(dòng)子，熒光篩選標(biāo)記基因采用綠色熒光蛋白基因(gfp)或者紅色熒光蛋白基因(dsred)，熒光篩選標(biāo)記基因表達(dá)框的啟動(dòng)子采用ie-1、a3或者3xp3啟動(dòng)子。

27、所述的復(fù)合絲蛋白的組成包含了家蠶表皮蛋白基因rr-1、rr-2、rr-3、cpg、cph或glycine-rich中的1個(gè)基因構(gòu)成的蛋白分子成分和蠶絲蛋白成分，本發(fā)明采用基因操作結(jié)合理化處理的體內(nèi)外聯(lián)合作用，增強(qiáng)了復(fù)合絲的力學(xué)機(jī)械性能。

28、隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了大量的表皮蛋白基因序列。根據(jù)表皮蛋白的氨基酸基序(motif)特征，可以分成若干蛋白家族。大多數(shù)的表皮蛋白含有r&r保守基序，而r&r基序的表皮蛋白還可以進(jìn)一步細(xì)分為3個(gè)亞家族：rr-1,rr-2和rr-3。

29、家蠶表皮蛋白基因在染色體上大多以串聯(lián)集群形式分布，2008年的研究推測(cè)在家蠶基因組中一共有220個(gè)的表皮蛋白基因，甚至可能有247個(gè)表皮蛋白基因，根據(jù)其基序特征可以被分為8個(gè)家族，屬于rr-2亞家族的表皮蛋白數(shù)量最多。

30、本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，由rr-1、rr-2、rr-3、cpg、cph或glycine-rich表皮蛋白構(gòu)成的重組絲，并經(jīng)結(jié)合理化處理的復(fù)合絲應(yīng)力性能、應(yīng)變性能、耐磨性能、抗皺性能顯著提高，可以開發(fā)新型復(fù)合絲，拓展蠶絲新用途。

31、本發(fā)明是創(chuàng)造性地將表皮蛋白與蠶絲構(gòu)建復(fù)合絲，再經(jīng)過(guò)理化處理獲得了能夠提高家蠶復(fù)合絲力學(xué)機(jī)械性能的蛋白序列。

32、本發(fā)明具有的有益效果是：

33、本發(fā)明開發(fā)了一種蠶絲蛋白人工設(shè)計(jì)、合成功能基因及其提高家蠶復(fù)合絲力學(xué)機(jī)械性能的方法，并開發(fā)了多種基因的新功能，利用這種基因獲得了復(fù)合絲再經(jīng)理化處理復(fù)合絲力學(xué)性能顯著增強(qiáng)，這種發(fā)明能極大的改良蠶絲品質(zhì)，創(chuàng)造很好的經(jīng)濟(jì)效益。